2013.11.04FISH技术检测自然流产中绒毛染色体异常与男女双方叶酸含量的临床应用研究技术报告 - 20121109.doc

自然流产绒毛染色体异常与血液中叶酸水平的相关性研究技术报告 选项背景 导致自然流产的原因较多，如遗传基因缺陷、母体因素、胎盘内分泌功能不足、环境因素、免疫因素等，有关资料研究显示男女方叶酸缺乏也会导致自然流产。其中遗传基因缺陷导致自然流产时，多为三体、三倍体及X单体等染色体数目异常，其次为断裂、倒置、缺失和易位等染色体结构异常。遗传基因缺陷的胚胎多数结局为自然流产，极少数可能继续发育成胎儿，但出生后也会发生某些功能异常或合并畸形。国外数据表明，孕妇前三个月、中三个月、后三个月自然流产染色体异常率分别为60%、10%-20%、5%-10%。其中较为常见的染色体异常有X单体，发生率约为20%；16号染色体三体，发生率约为16%；18号染色体三体，发生率约为3%；21号染色体三体，发生率约为5%；22号染色体三体，发生率约为5%。通过检测这些自然流产胎儿的常见染色体异常情况，可以为下一代妊娠进行遗传咨询提供资料。如果孕妇自然流产是由于染色体异常引起的，那么下一代有染色体异常的风险较普通人群高；若孕妇下一代为自然怀孕则可选择绒毛或羊水做产前诊断，如果下一胎选择体外受精（in-vitro fertilization,IVF）,则可做胚胎植入前遗传学诊断(Preimplantation Genetic Diagnosis,PGD)。 流产染色体分析目前主要是对流产绒毛进行培养，分析染色体异常的情况，但此项技术比一般羊水培养核型分析困难，在我国只有少数产前诊断中心掌握并能应用，因此大多数产前诊断中心及妇产科没有开展针对流产组织细胞的培养及核型分析检测。荧光原位杂交（FISH）技术是目前国际上比较先进的检测染色体异常的方法，其灵敏度高，所需细胞量少，无需培养，技术容易被掌握。从标本的制备到原位杂交结果分析完成可在48小时内完成，比常规的G-显带染色体核型分析快得多。我们这里FISH测定染色体探针主要针对13、16、18、21、22、X、Y染色体，对于整倍体来说FISH不够全面，所以在取材时同时做快速绒毛检测验证FISH结果。 然而，有关自然流产染色体异常与男女双方叶酸含量之间的关系，国内尚未见相关的系统报道。利用FISH检测绒毛染色体，同时检测夫妇双方血清叶酸水平，寻找血清叶酸含量与染色体畸变二者的关系。 检测血清叶酸水平含量同时检测叶酸代谢过程中关键酶的编码基因的位点多态性（SNPs），探讨区域性亚甲基四氢叶酸还原酶蛋白编码基因MTHFR和甲硫氨酸合成酶还原酶编码基因MTRR的多态分布与叶酸含量及自然流产的相关性。 技术路线 （一）、标本类型：流产绒毛 （二）、操作流程： 【样本玻片制备】 试剂耗材：生理盐水、KCL低渗溶液、甲醇、冰醋酸等 仪器设备：无菌剪刀或镊子、培养皿、量筒、移液器、塑料吸管、离心管、载玻片、盖玻片、计时器、温度计、水浴锅、显微镜等 玻片制备程序： 1、取新鲜流产或胎儿组织，用生理盐水洗净。 （胎儿组织可以选取肌肉，最好去掉皮肤，避免角质成分的影响） 2、无菌剪刀或镊子去掉蜕膜组织，选取绒毛或其他组织，剪碎，该操作可在显微镜下进行。（注意避免母体细胞污染） 3、低渗。取标本约3-5mg，加入5 ml 预热至37℃的0.075M KCl溶液，37℃低渗20分钟，期间轻轻吹打悬浮细胞1－2次。 4、预固定。缓慢加入2 ml 固定液（甲醇:冰乙酸=3:1），轻轻吹打混匀后1800 rpm，离心10分钟。 5、固定。去上清，加入5ml固定液，混匀，期间吹打1次，1800 rpm，离心10分钟。 6、固定。重复步骤5。 7、消化。去上清，加1ml冰醋酸消化约1分钟，加3ml甲醇终止消化。 8、细胞悬液的制备和保存。离心，去上清，根据细胞量加适量固定液混匀后滴片。 9、老化玻片。56℃烤片30min。室温干燥保存。 【玻片预处理及变性杂交】 试剂耗材：2×SSC、0.01M HCL、胃蛋白酶工作液、乙醇等 仪器设备：水浴锅、计时器、温度计、镊子、Ep管、PH计、移液器、杂交仪、盖玻片等 玻片预处理程序： 1、室温下于2XSSC（pH 7.0）溶液中漂洗玻片5 min。 2、消化。37℃下终浓度0.05mg/ml胃蛋白酶工作消化5分钟，可根据实际情况进行调整。 3、室温下于2XSSC（pH 7.0）溶液中漂洗5min。 4、将玻片依次置于 70%乙醇、85％乙醇、100％乙醇中各3min脱水，自然干燥。 5、探针配制。按照下表中体系进行。 名称 体积（ul） 杂交缓冲液 8.0 探针 2.0 ∑ 10.0 6、离心1-3秒，涡旋混匀后再次短暂离心。 7、变性杂交 杂交仪变性杂交（自动操作） 将10μl探针混合物滴加于玻片杂交区域，立即加盖盖玻片，用橡皮胶封边。 杂交仪共变性。共变性条件：75℃，6分钟，杂交条