ICS11.220.doc

ICS11.220 B 41 DB21 辽宁省地方标准 DB XX/ XXXXX—XXXX 新城疫免疫抗体监测技术规范 Technical specification for monitoring immune antibody of Newcastle disease 点击此处添加与国际标准一致性程度的标识 （本稿完成日期：2015.3.12） XXXX - XX - XX发布 XXXX - XX - XX实施 辽宁省质量技术监督局发布 前言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。 本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。 本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。 本标准主要起草人：王宏燕、赵晓彤、薛树山、闫海滨、马建山、石霖、李清竹、吴运谱、何欣、 王志国、赵鹏、李晓楠。 新城疫免疫抗体监测技术规范 范围 本标准规定了新城疫免疫抗体监测技术中的样品采集和制备、血凝试验、血凝抑制试验的操作规程和综合判定。 本标准适用于新城疫疫苗免疫抗体监测。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 16550-2008 新城疫诊断技术 缩略语 下列缩略语适用于本标准。 HA：血凝（hemagglutination） HAU：血凝单位（hemagglutination unit） HI：血凝抑制（hemagglutination inhibition） 器材与试剂 器材：普通天平、分析天平、普通离心机、微型振荡器、冰箱、高压灭菌器、微量移液器、滴头、96孔90度V形血凝反应板。 阿氏液(Alsevers Solution)：配制方法参见附录A中A.1。 pH7.2 0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）：配制方法参见附录A中A.2。 1%鸡红细胞悬液：配制方法参见附录A中A.3。 标准新城疫病毒抗原、阳性对照血清和阴性对照血清。 抽样样本量大小的确定 无限群抽样样本量n值的计算 按照预期新城疫免疫抗体合格率为70%,可接受的最大绝对误差为5%，置信水平为95%，根据公式n=p(1-p)×z2/e2计算出n值，其中z值为95%置信水平对应的标准正态分布1-α/2百分位点，为1.96，将p=0.7、z=1.96、e=0.05计算出n值为323。 有限群抽样样本量nα值的计算 根据公式nα=n×N/(N+n)，计算出群体实际抽样数量，其中N为群体数量，nα为抽样数量。 样品采集和制备 血液采集 将鸡侧卧保定后，用酒精棉球消毒翅静脉窝区，在距离翅静脉窝约0.3 cm处，使针管与近心端保持45度进针，稍稍将针头轻插进血管，轻拉活塞，当有血液开始被吸出后，保持注射器位置不动，让血液缓缓吸入注射器针管内，达到所需的采血量后，用棉球压迫血管上的伤口约30 s。 血清分离 采集到血液后，立即将针头拔掉，把注射器内的血液沿着试管壁徐徐注入，不能有气泡，也不能振荡。逐一编号，仔细核对，倾斜放置。血液样品夏天在常温下冬天在25～37温中放置1h左右，析出血清～GB/T 16550-2008 新城疫诊断技术的要求配制4个血凝单位（4HAU）的新城疫病毒抗原。 4HAU抗原回滴 取血凝反应板，在A1～C5孔加入0.025 mL PBS。 吸取0.025 mL 4HAU新城疫病毒抗原，加入A1～C1孔，混匀后倍比稀释至A4～C4孔，混匀后吸取0.025 mL弃去。 A1～C5孔中补加0.025 mL PBS。 A1～C5孔加入1%鸡红细胞悬液，A5～C5孔为红细胞对照。 振荡混匀后，在20 ℃～25 ℃条件下静置40 min后观察结果。 当红细胞对照孔A5～C5孔中的红细胞呈明显的钮扣状沉到孔底时，判定结果。A1～C2孔完全凝集，则4HAU抗原配制准确；仅A1～C1孔完全凝集或A1～C2孔均有红细胞流淌，需补加病毒抗原；A1～C3孔或A1～C4孔完全凝集，需补加PBS。若4HAU抗原回滴出现上述后两种情况，则需要重新回滴，直至回滴准确。 HI试验操作 取血凝反应板，在A1～H11孔加入0.025 mL PBS，A12～H12加入0.05 mL PBS。 吸取待检血清0.025 mL加入A1～A6孔中，吸取新城疫阳性血清加入A7孔，阴性血清加入A8孔，混匀后，同时倍比稀释至A10～H10，混匀后弃去0.025 mL。 A1～H11孔加入回滴好的4HAU抗原，A11～H11为4HAU抗原对照。 振荡混匀后，在室温20℃～25℃条件下放置30 min。 A1～H12加入1%鸡红细胞悬液，A12～C12孔为红细