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断面修复过程微生物生态变化研究 张洪勋 李珂 （中国科学院大学资源与环境学院） 1、课题背景和意义 我国高速公路的迅猛建设虽然带动了区域经济发展，然而对沿线的生态环境带来了很大的压力，特别是生态环境脆弱地带，使自然人文景观、生态环境都受到严重的破坏。随着道路设计标准的逐步提高，路基填挖高度加大，势必造成大量的高填深挖路段，严重破坏公路沿线的原有生态特性。另外，在施工过程中的乱挖、乱弃土石方，大量的废弃物堵塞河道，施工破坏原有植被与原状水系统造成的水土流失，直接后果是对自然环境改变与破坏，造成生态失衡(徐广彬 2011)。 生态恢复对于公路建设而言有特殊意义，微生物修复是生态修复的一部分，并且同植物修复互为作用，对于生态环境的恢复有重要的贡献。土壤微生物是土壤生态环境的重要生命体，它不仅可以指示土壤的生态稳定性，而且还具有巨大的潜在环境修复功能(滕应, 骆永明 et al. 2007)。目前，关于微生物生态修复的研究大量出现，涉及微生物固碳、对有机物、重金属污染土壤以及煤矿废弃地的修复等(李珂 and 张洪勋 2014；李顺鹏 and 蒋建东 2004; 李荣林, 李优琴 et al. 2005; 崔树军, 谷立坤 et al. 2010; 王凤花, 罗小三 et al. 2010; 代稳, 朱清华 et al. 2012; 王丽娜 2013)，正是由于已经积累了诸多土壤微生物修复知识，开展土壤微生物于公路断面修复研究与应用具有重要的现实意义。 受破坏的公路断面生态环境条件脆弱，土壤贫瘠，植被的覆盖率低，但是土壤微生物却普遍存在。土壤微生物能够通过自身的生理特性，改善土壤的物理性质，起到保护土壤的作用。土壤表层的藻类则能够通过光合作用固定空气中的C02，是土壤表层固碳的重要贡献者。有了碳源，就可提供其他异养微生物生存的能量来源，进而使土壤肥力增加。此外，固碳量的大小不仅受自然条件的约束，也与藻类的组成密切相关(李珂 and 张洪勋 2014)，因此断面修复过程中微生物的群落结构（微生物的多样性及丰度）可作为断面修复效果的评估指标。从应用的角度来看，筛选抗逆能力强的藻类，应用于断面修复将会起到事半功倍的作用。如优化其固碳条件，使其能够以更高效率的修复断面生态，显然具有重要的实际意义。 2、课题目标 2.1获得断面修复过程中微生物多样性及数量变化的数据，建立固碳微生物修复指标，应用于评估断面恢复状况。 2.2 分离纯化抗逆藻类，优化固碳条件，为提高断面修复效率工艺改进提供技术基础。 3、研究技术路线及研究内容 3.1 断面修复过程中微生物群落结构的调查 1）微生物多样性调查 断面的土壤样品采用FastDNA SPIN kit for soil (Bio101 System Germany)提取DNA，提取过程按照说明书进行。采用高通量测序获得断面土壤中细菌和真菌的序列数据，分析优势藻类及其他微生物。 2）微生物丰度调查 微生物的丰度是土壤中微生物含量的一种表征方式。采用荧光定量PCR，对断面中的优势藻类及其他微生物菌种进行定性定量分析。 该研究的技术路线图如下所示： 图1 研究技术路线图 3.2获得高效率断面恢复速度 1）藻类的分离培养 在容积为250mL 的三角瓶内，加入100mL的液体BG-11培养基，灭菌备用，然后把5 g的土壤样品加入液体培养基中，充分震荡，在25℃，70μE m-2s-1条件下培养 2 周后，一部分接种于固体培养基中涂平板，并进行划线法分离纯化藻类，剩余样品在显微镜下进行观察。 2）纯种藻类的鉴定及藻结皮固碳条件的优化 纯种藻类在液体培养基中培养两周后，可看到三角瓶中有蓝绿色的藻类生长，取液体培养液中的藻类，制成临时装片，在显微镜下进行观察并拍照，并根据(Drouet 1981; Tirkey and Adhikary 2006; 胡鸿钧 and 魏印心 2006)等相关参考文献将其鉴定到属或种。 纯种的优势藻用BG-11培养基在室温通气培养，光照为40μE m-2s-1，15天后，将培养物喷雾接种于没有断面土壤表面（没有植物覆盖）。通过设置不同光照强度及湿度来观察结皮的生长状况(兰书斌, 胡春香 et al. 2010)。 参考文献 Drouet, F. (1981). Revision of the Stigonemataceae with a summary of the classification of the blue-green algae, J. Cramer Vaduz. Tirkey, J. and S. Adhikary (2006). Blue green algae in the biological soil crusts of d