DNA重组技术-测序2.docVIP

利用DNA重组技术对禽流感病毒NS基因进行序列测定和遗传进化分析 实验分组：每人一组 实验目的：1、掌握DNA重组技术的基本原理 2、掌握DNA重组技术的基本操作方法 3、熟悉遗传进化分析相关分子生物学软件的使用方法 实验原理：DNA重组技术 实验仪器：微量移液器、低温高速离心机、水浴锅、PCR仪、凝胶成像系统 实验耗材：乳胶手套、PE手套、一次性口罩、相关分子生物学试剂 实验步骤：1、病毒RNA的提取 2、发转录(RT) 3、PCR 4、PCR产物的回收与纯化 5、回收产物鉴定 6、连接 7、转化 8、挑取单克隆扩大培养 9、菌液鉴定 10、测序 11、序列分析 实 验 步 骤 提取病毒RNA 整个过程用DEPC水（0.01%），RNA不溶于酒精，但溶于水。Ep管、枪头必须在DEPC水（0.1%）浸泡24h以上，以除去RNA酶，然后灭菌30min。最好戴手套、口罩，一定记得按实验要求更换枪头。实验开始前将75%乙醇(DEPC水配置)由冰箱4℃放入-20℃中，将离心机打开并将温度调至4℃、转数调至12000rpm，将水浴锅分别打开42℃和70℃。 1.取n个1.5ml灭菌的Eppendorf管，其中n-2个为待测尿囊液、一个为阳性对照、一个为阴性对照，对每一管进行编号。 2.每一管中加入对应编号的待测尿囊液、阳性对照、阴性对照各200μl，再在各管中加入600μl的Trizol裂解液。 3.振荡器充分震荡，每个90s。 4.静置5min。 5.各管中加入200μl的三氯甲烷（氯仿），混匀，静置2min。 6.4℃，12000rpm5xBuffer 5μl dNTP Mixture(2mM each) 5μl Reverse Transcriptase M-MLV(200U/μl) 0.5μl Rnase Inhibitor(40U/μl) 0.5μl DEPC水 dNTP Mixture（2mM each）μl Primer(20pM) 1μl TaqE(5U/μl) 0.25μl Template 1.5μl ddH2O up to 25μl 表3 引物NS PCR反应条件 温度 时间 95℃ 5min 94℃ 30s 52℃ 30s 72℃ 30s 72℃ 10min 4℃ ∞ 运行30 个循环 2．PCR结果鉴定 使用TAE缓冲液配制1%琼脂糖凝胶，然后对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用凝胶成像系统成像，拍照保存，观察结果。出现960bp目的条带的判定为AIV阳性，没有960bp目的条带出现的判定为AIV阴性。 3．PCR扩增需要测序的目的条带 对目的条带进行扩增一般使用较大的PCR体系（一般使用75-100μl），PCR反应体系见表2，PCR反应条件根据不同引物对表3进行不同的修改，PCR结束之后进行琼脂糖凝胶电泳。 PCR产物的回收与纯化 回收前应将水浴锅分别打开75℃和65℃，并计算好该次回收所要用到的Eluent的量，多于该量的分装到新的Ep管中，放入到65℃水浴锅中预热。如果使用去离子水，则应该取一管新的分装好的去离子水放入65℃水浴锅中预热。 1．在紫外灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。计算凝胶重量（提前记录1.5ml离心管重量），该重量作为一个凝胶体积（如100mg=100μl）（第一步可忽略）。 2．加入3个凝胶体积的Buffer ED-A（为了方便离心的时候配平，平时操作时，无需进行第一步计算凝胶重量，直接加入700μl Buffer DE-A），混合均匀后于75℃加热（低熔点琼脂糖凝胶于40℃加热），间断混合（每2-3min），直至凝胶块完全熔化（约6-8min，一般都是10min）。 ∵Buffer DE-A为红色溶液。在熔化凝胶的过程中，可以帮助观察凝胶是否完全熔化。 3.加0.5个体积Buffer DE-A体积的Buffer DE-B（加入350μl即可），混合均匀。当分离的DNA片段小于400bp时，需再加入1个凝胶体积的异丙醇。 ∵加Buffer DE-B后混合物颜色变位黄色，充分混匀以保证形成均一的黄色溶液。 4．吸取步骤3中的混合液，转移到DNA制备管（置于2ml（试剂盒内提供）离心管）中，12,000rpm，离心1min。弃滤液。 5．将制备管置回2ml离心管，加500μl Buffer W1，12,000rpm离心1min，弃滤液。 6．将制备管置回2ml离心管