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中文使用说明书 North2South 生物素标记和化学发光检测试剂盒 目录号: 17175 （17075，37549，37555，89880） 该试剂盒由探针标记，杂交洗膜和化学发光检测三部分组成 17075（探针标记，纯化和定量） North2South?生物素随机引物Kit(该试剂盒含有足以完成10次标记反应的试剂，每次可合成至少1ug的生物素标记的探针) 产品名称： 货号 产品描述 17075 North2South?生物素随机引物Kit 10次标记反应，每次可合成至少1ug的生物素标记的探针) Kit 组分: Heptanucleotide mix (5X), 100 μl dNTP mix (5X) (1 mM dATP, 1 mM dTTP, 1 mM dGTP, dCTP), 80 μl Reaction Buffer (10X), 50 μl DNA Polymerase, Klenow fragment (3′-5′ exo-),(10 units/μl), 10 μl Non-biotinylated control DNA*, (250 ng/μl), 5 μl EDTA, (500 mM, pH 8.0), 1 ml Nuclease-free water, 1 ml NH4OAc, (5 M), 1 ml Biotin-N4-dCTP, 20 μl 储存条件： 所有试剂应该在无霜冷冻－20°冰箱保存 探针标记： 操作步骤： 将20ul生物素标记的N4-dCTP与80ul的5XdNTP混合物充分混合备用（总量100ul） 稀释约100ng线性探针模板至24ul于离心管中 (模板DNA要定量和纯化) 加入10ul随机引物（Heptanucleotide mix）于上述离心管中，煮沸变性5分钟，迅速在冰水混合物退火5分钟 加入10ul N4-dCTP与5XdNTP的混合物，5ul 反应缓冲液，1ul Klenow酶片断，混匀 37°孵育60分钟 加入2ul EDTA以灭活Klenow酶活性 探针纯化 操作步骤： 加入5ulNH4OAC于上述50ul反应离心管，吹打混匀 加入110 ul 冰预冷的无水乙醇，充分混匀，冰或－70°放置15分钟 12000rpm 4°离心15分钟 观察沉淀情况，小心吸取出上清，风干沉淀 用冰预冷的70％乙醇洗涤一次，12000rpm 4°离心15分钟，观察沉淀情况，小心吸取出上清，风干沉淀 50ulTE或RNA酶free 的水溶解沉淀（－20℃或－70℃长期保存） 探针定量（17075） 操作步骤： 500ul去离子水，260nm调零 充分混匀2.5ul 探针和47.5ul 去离子水（即稀释20倍）分光光度计测定OD260值 定量计算公式：1 OD260 dsDNA = 50 μg/ml； 样品浓度（μg/ml）=OD值X50X稀释倍数; 样品浓度μg/ul= OD260值X50X20/1000 样品浓度ng/ul= OD260值X50X20（注：如果稀释20倍，实际测定的OD260值应该在0.02－0.05之间） Note:大多数情况下，由于各实验室用来测定核酸的仪器不同，检测灵敏度不同以及样品中的一些干扰物质，测出的OD值往往是0甚至是负值，如果出现这种情况，再进行核酸定量没有实际价值，因此，根据经验，保守估计，在每次至少合成1ug探针的前提下，在杂交时，探针的用量按照每ul含有20ng探针来使用，即每毫升杂交液加入变性的纯化过的探针1.5-2ul. 杂交和洗膜 产品名称：杂交缓冲液和严谨洗膜缓冲液 货号 产品描述 37549 North2South? Hybridization Buffer Component, 125 ml 37555 North2South? Hybridization Stringency wash Buffer（2X）, 375 ml 储存条件：4℃ 点杂交；样品转膜（带正电尼龙膜） 使用前将所有试剂放到室温下，保证所有buffer 溶解充分，没有颗粒。 调节烘箱和温箱至适当杂交温度（DNA杂交55℃，RNA:RNA杂交65℃） 处理膜时只能用干净的镊子小心夹住膜的边角。我们建议在两个操作步骤间用乙醇清洗镊子并干燥待用。杂交和第一次洗膜之间改换洗膜容器和将使膜更干净。 杂交、洗膜和检测时不能让膜干燥。 杂交 具体操作步骤： 平衡杂交液到室温 预杂交:将转好的膜置于杂交管，点样面朝上，确保膜被杂交缓冲液均匀覆盖，杂交炉要缓慢转动以保证杂