扫描电子显微镜样品制备技术资料分析.doc

扫描电子显微镜样品制备技术　　　韩玉泽 扫描电子显微镜样品制备技术 扫描电镜所收集的主要是电子束照射在样品上所产生的二次电子,一般扫描电镜图象均为二次电子图象.由于扫描电镜具有高分辨率,景深长等特点,故其图象层次丰富,立体感强,可显示细胞和组织的三维结构形貌,故广泛应用于生物样品表面及其断面的微细结构观察. 近年来,扫描电镜所取得的迅速发展表明,仪器本身性能如分辨力和多功能等的不断提高固然重要,但样品制备技术的改良和日趋完善,对扫描电镜的应用与发展确实起到了积极促进作用,因此样品制备的质量,是直接决定扫描电镜能否发挥最佳性能并排除理想图片的关键所在.所以,自1966 年第一台商品扫描电镜诞生以来,扫描电镜样品制备技术问题,一直是电镜工作者们苦心钻研,不断创新的一个重要领域 扫描电镜生物样品制备的基本要求 生物样品与金属﹑矿物材料不同,它具有质地柔软,容易变形﹑导电性能差﹑二次电子发射率底以及含水量多(有的含水可达80％以上)等特点.因此,在对于高真空状态下的生物 针对生物样品的特殊性,在进行扫描电镜样品制备时,一般要掌握以下原则: (一)每一操作过程,都应注意防止对样品的污染和损伤,使被观察的样品尽可能地保持原有的外貌及微细结构. (二)去除样品内水份,以利于维持扫描电镜的真空度和防止对镜 (三)降低样品表面的电阻率,增加样品的导电性能,以提高二次电子发射率,建立适当的反差和减少样品的充放电效应. (四)无论观察组织细胞的表面或内部微细构造,都应注意确认和保护样品的观察面. 二、SEM生物样品制备的基本操作程序 在SEM生物样品制备过程中，除比较坚硬的组织（如骨骼、牙齿、指甲、毛发，贝壳、昆虫及某些植物样品）需要采用某些特殊制备技术者（如管道铸型扫描、低电压观察法等）以外，一般生物组织均需要经过取材、清洗、固定、脱水、干燥及金属镀膜等基本程序处理以后，才能进行SEM观察。 SEM生物样品制备的基本程序 （一）取材 SEM样品的取材，与透射电镜的超薄切片法一样，是整个样品制备过程中的关键步骤之一。其主要要求有以下几点： 1．取材前应作好药品及器材准备，并根据实验的目的与需要，制定取材方案。每次取材的品种及数量不宜过多，以免延误时间、影响制样效果。 2．取材部位要准确，取样大小要适当。以观察组织细胞表面结构为主的样品可以大一些，其直径最大不宜超过5mm，高度可在3～5mm之间。以观察组织细胞内部结构为主的样品，其直径应小于2mm，高度可在3mm左右。为了提高固定、脱水、干燥及镀膜效果，在满足所需要观察内容的条件下，样品块以尽量小一些为宜。 3．为了使被观察的样品更近于活体状态，材料应尽量新鲜。取材用的刀片要锋利，操作要轻巧敏捷，严防对样品的挤压损伤，同时应作好对样品观察面的标记。 （二）样品的清洗 1．清洗液的选择 清洗时应根据不同的样品和要求，选用适当的清洗液： （1）对干贴附于一般组织表面的血液、粘液和其他分泌物，可选用等渗的生理盐水、5％碳酸钠溶液或与固定液相应的缓冲液进行冲洗。 （2）游离细胞如精子、血细胞等，以及处于悬浮液中的微生物、寄生虫等细小的样品，可选用缓冲液或等渗溶液进行清洗。 （3）表面覆盖大量粘液的样品如胃肠粘膜等，可在样品初固定之后，选用不同的低浓度蛋白水解酶（胰蛋白酶、糜蛋白酶等）或其他具有水解作用的溶液（N一乙酰半胱氨酸等），对样品进行处理。 （4）组织培养细胞的清洗，一般以选用相应的组织培养液为宜。 （5）某些特殊样品则需针对性地选用一些特殊的清洗液,才能取得满意的清洗效果.例如,覆盖于内耳壶腹嵴表面的胶质状膜,需用5～10％盐酸浸泡才能被清除；又如乳腺组织，因其含有多种蛋白质与脂类为主要成分的乳汁,所以需分别用16％甘油和20％乙醇浸泡处理,才能清洗干净。 （6）一般样品固定后的清洗,大都选用相应的缓冲液,但在制样过程中,每更换一次试剂,为了消除可能出现于样品表面的反应沉淀物,均需用双重蒸馏水进行充分清洗。 2、清洗的方法 （1）比较干净的组织可在固定后清洗，其具体方法是：将样品放入干燥的玻璃小瓶内，倒入足够量的清洗液（最少为样品体积的20倍），按一定方向轻轻摇动小瓶，并反复更换新清洗液，以达到充分清洗的目的。 （2）表面覆盖大量粘液和杂质的样品，宜在固定前清洗。为了提高清洗速度和效果，对一些粘着杂质多而紧密的样品，可利用振荡器进行清洗或用注射器（或喷射瓶）加压冲洗。清洗所用的时间，可根据样品附着物的情况而定。 　　（3）游离细胞、微生物及其他微小生物样品的清洗，一般采用离心清洗法。具体步骤为：将固定后的样品放入刻度离心管内，注入与固定液相应的缓冲液或用磷酸缓冲液配制的20％NaCl缓冲盐溶液