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蛋白质纯化常用溶液体系 亲和层析（AC）为实验室常用的纯化方法，特别是IMAC(Immobilized Metal-ion affinity chromatography) ，我们现在常用到的是Ni-NTA来纯化带6个组氨酸标签的目的蛋白。蛋白样品 处的溶液体系直接决定了后期纯化的效果。 Native condition： Binding buffer：50mM磷酸盐缓冲液，0.5M NaCl. pH 8.0 有的做法在Binding buffer 加少量的咪唑，减少非特异性的结合！ Wash buffer： 50mM磷酸盐缓冲液，0.5M NaCl. 40mM咪唑 pH 8.0 这里可以降低pH值至4-5 除去咪唑不能除去的杂蛋白 Elution buffer: 50mM磷酸盐缓冲液，0.5or 1M NaCl. 250mM咪唑 pH 8.0 Denature condition: Binding buffer： 100mM NaH2PO4 ; 10mMTris Cl; 8M Urea pH 8.0(adjust pH to 8.0using NaOH) Wash buffer： 100mM NaH2PO4 ; 10mMTris Cl; 8M Urea pH 6.0(adjust pH to 6.0using HCl) Elution buffer:100mM NaH2PO4 ; 10mMTris Cl; 8M Urea pH 4.5(adjust pH to 4.5using HCl) 使用Urea 的时候 需要现配现用！防止尿素分解后的产物使蛋白变性! 另外变性条件下进行蛋白纯化的时候 一定在使用前调整好各种buffer的pH值。 我的纯化中所用到的buffer中均加了10%甘油，以减少蛋白间的疏水作用，稳定蛋白。 * 蛋白质分离纯化浅谈 蛋白样品的预处理 细胞的破碎是基因工程上下游的分界；一般采用温和的选择性抽提；大肠杆菌的渗透冲击抽提 可以获得胞内表达的60kD的蛋白。菌体裂解常用的方法： 一、渗透冲击法： 冲击液1：1mM EDTA；50mM磷酸盐缓冲液，20%蔗糖，pH8.0 冲击液2：50mM磷酸盐缓冲液，pH8.0 将诱导的大肠杆菌，5000g 离心5min，收集菌体； 菌体用冲击液1（按大肠杆菌与冲击液体积比10：1）打散冲击，冰浴30min，5000g离心5min，收集菌体。 这里可以结合冻融法！ 菌体再用冲击液2（按大肠杆菌与冲击液体积比10：1）打散冲击，冰浴20min，12000g 4℃离心10min，取上清液，即可得到粗制的样品溶液。 二、溶菌酶裂解法 将诱导的大肠杆菌，5000g 离心5min，收集菌体； PBS 洗3遍；加入溶菌酶，终浓度一般是4mg/mL；但是如果你的表达菌是BL21的话，那么你就要适量的少加（1mg/mL），因为BL21菌株本身自带溶菌酶。 反应条件我是在37 ℃水浴中杂交炉作用1-2h。根据你的时间和蛋白的稳定性，也可以在4 ℃冰箱过夜的。  三、超声裂解法 超声破碎 缺点是发热，剪切力强烈。纯化活性蛋白的时候最好少用。 (1). 要设定好超声时间和间隙时间，一般每次超声时间不超过5秒，间隙时间最好大于超声时间，这些都有利于保护蛋白的活性。我的实验超声时间5秒、间隙时间10秒、工作次数60次 （5min）。具体的超声条件，可以自行摸索！ (2) . 一般超声用的溶液为binding buffer 10mL/g菌体湿重，超声时的溶液最好放在玻璃烧杯中 有利于散热！增大溶液体积，也有利于充分超声裂解。 (3) . 如果是表达蛋白可溶，而且菌液浓度合适时，超声后菌液应该变澄清。表达包涵体的菌液超声到液体发淡淡的白灰色即可。也可以用显微镜检测完整菌量，再决定是否再继续超声。 四、反复冻融法 1、将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。2、至少3次以上冻溶。3、用液氮冻融三四次就可以了，细胞冻住后，取出放37度水浴，溶解后震荡，再冻 。 五、裂解液处理法：1、细胞裂解液：50 mmol/L Tris-Cl pH 6.8，100 mmol/L DTT，2% SDS，0.1%溴酚蓝，10%甘油。SDS是阴离子型表面活性剂、极易促溶、强变性作用。2、如果是做小量菌液，跑PAGE胶看其表达情况的话，可以直接加蛋白loading buffer煮沸5分钟即可。 蛋白样品的浓缩，可以采用硫酸铵沉淀或者超滤管进行样品的浓缩； 我一般用超滤管进行样品的浓缩比较多。硫酸铵沉淀比较经济，蛋