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酶及生物催化剂概念的发展 酶学研究简史 公元前两千多年，我国已有酿酒记载。 一百余年前，Pasteur认为发酵是酵母细胞生命活动的结果。 1877年，Kuhne首次提出Enzyme一词。 1897年，Buchner兄弟用不含细胞的酵母提取液，实现了发酵。 1926年，Sumner首次从刀豆中提纯出脲酶结晶。 1982年，Cech首次发现RNA也具有酶的催化活性，提出核酶(ribozyme)的概念。 1995年，Jack W.Szostak研究室首先报道了具有DNA连接酶活性DNA片段，称为脱氧核酶(deoxyribozyme)。 *各部分在催化反应中的作用 酶蛋白决定反应的特异性 辅助因子决定反应的种类与性质 （三）酶的不同形式 单体酶(monomeric enzyme)：仅具有三级结构的酶。 寡聚酶(oligomeric enzyme)：由多个相同或不同亚基以非共价键连接组成的酶。 多酶体系(multienzyme system)：由几种不同功能的酶彼此聚合形成的多酶复合物。 多功能酶(multifunctional enzyme)或串联酶(tandem enzyme)：一些多酶体系在进化过程中由于基因的融合，多种不同催化功能存在于一条多肽链中，这类酶称为多功能酶。 1. 米－曼氏方程式 中间产物 推导过程 稳态：是指ES的生成速度与分解速度相等，即 [ES]恒定。 K1 ([Et]－[ES]) [S]＝K2 [ES] + K3 [ES] （三）酶浓度对反应速度的影响 当[S]＞＞[E]，酶可被底物饱和的情况下，反应速度与酶浓度成正比。 关系式为：V = K3 [E] (１). 竞争性抑制作用 定义 抑制剂与底物的结构相似，能与底物竞争酶的活性中心，从而阻碍酶底物复合物的形成，使酶的活性降低。这种抑制作用称为竞争性抑制作用。 (2). 非竞争性抑制 * 反应模式 (３). 反竞争性抑制 * 反应模式 当底物浓度很高，将酶的活性中心全部饱和时，即[Et]＝[ES]，反应达最大速度 Vmax＝K3[ES]＝K3[Et] (5) [ES]＝─── [Et][S] Km + [S] (3) 整理得: 将(5)代入(4)得米氏方程式： Vmax[S] Km + [S] V＝──── 将(3)代入(1) 得 K3[Et][S] Km + [S] (4) V＝──── 当反应速度为最大反应速度一半时 Km值的物理意义 Km＝[S] ∴Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是mol/L。 2 ＝ Km + [S] Vmax Vmax[S] Vmax V [S] Km Vmax/2 3. 米氏常数的意义及测定 意义： Km值为酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，是酶的特征性常数。 （1） km是酶的一个基本的特征常数。其大小只与酶的性质有关，而与酶的浓度无关。且随着温度、pH和离子强度而改变。 （2）从km可判断酶的专一性和天然底物。 Km最小的底物，通常就是该酶的最适底物，也就是天然底物。 （3）当k2＞＞k3时， km的大小可以表示酶与底物的亲和性。 ∵ km= （k2 +k3)/k1 Km ≈ k2 / k1 S + E ES E + P ∴ km可以看作ES的解离常数ks ： km= ks = ———— [S][E] [ES] 当km大，说明ES容易解离，酶与底物结合的亲和力小。 （4）从km的大小，可以知道正确测定酶活力时所需的底物浓度。 [S] v 1000km 0.999V 100km 0.99V 10km 0.91V 3km 0.75V 1km 0.50V 0.33km 0.25V 0.10km 0.091V 从米氏方程中求得： 当反应速度达到最大反应速度的90%，则 90%V =100%V[S]/(km +[S]) v = —————— Vmax · [S] km + [S] 即 [S] = 9km 在进行酶活力测定时，通常用10km的底物浓度即可。 （5）km还可以推断某一代谢物在体内可能的代谢途径及限速步骤。 丙酮酸 乳酸 乙酰CoA 乙醛 乳酸脱氢酶（1.7×10-5） 丙酮酸脱氢酶（1.3×10-3） 丙酮酸脱羧酶（1.0×10-3） 当丙酮酸浓度较低时，代谢走哪条途径决定于km最小的酶。 A B C D E1 E2 E3 当底物浓度相差不大时，km最大的酶催化的反应往往是限速步骤 米氏常数可根据实验数据作图法直接求得：先测定不同底物浓度的反应初速度，从v与[S]的关系曲线求得V，然后再从1/2V求得相应的[