设计性论文.docVIP

中性红-透明质酸钠体系的共振瑞利散射光谱研究及其应用 摘要:在pH 4.3～5.2的Britton-Robinson 缓冲溶液中，中性红与透明质酸钠作用形成结合产物时将导致溶液共振瑞利散射（RRS）大大增强并产生新的RRS光谱，其最大散射峰位于328nm处。透明质酸钠在0～2.5mg/L范围内与RRS强度成正比。据此，建立了一种新的测定透明质酸钠的分析方法。该法具有高灵敏度，对透明质酸钠的检出限（3σ）为25.9ng/mL，选择性较好，应用于眼药水中透明质酸钠的测定，结果令人满意。 关键词:透明质酸钠；中性红；共振瑞利散射 透明质酸(Hyaluronic acid，简称HA)，又名玻璃酸、玻尿酸，是由N-乙酰基-D-氨基葡萄糖与D-葡萄糖醛酸交替构成的直链粘多糖。天然的透明质酸存在于透明体、脐带（1%～2%）、关节液、哺乳动物的血清、鸡冠、鲨鱼皮、鲸鱼的软骨和微生物中，是结缔组织胞间液的一个化学组成。在结缔组织和多数体液中，透明质酸与蛋白质，有时也与其他种类的粘多糖以缔合形式存在。透明质酸在使用时常将其转化为钠盐(Sodium Hyaluranate，以下简称SH)。 HA已被广泛应用于临床治疗、诊断，如在眼科术、治疗关节疾病、预防术后粘连、修复织、作为药物载体以及日用化妆品等方面，因此它的定量分析在医学、药学和化妆品行业中非常重要。目前常用的方法有生化方法、免疫法放射免疫(RiA)、酶联免疫法(ELISA)和免疫荧光法和光度法，但生化法选择性欠佳且操作繁琐，免疫法最大结合率低、使用周期短，且受检测仪器限制，不能普遍使用。 共振瑞利散射(RRS)或共振光散射(RLS)作为一种新的分析技术，因其高灵敏度和简易性引起了人们的关注。目前它已用于核酸[1，2]、蛋白质[3，4]、多糖[5‘6]等生物大分子的研究, 也用于痕量无机离子[7，8], 有机物[9]和某些药物的测定[10]。本文用中性红共振瑞利散射法测定SH。 碱性染料中性红（Neutral Red, 以下简称NR），在水溶液中以阳离子形式存在，将其用于糖胺聚糖SH的测定还尚未见报道。本文研究了NR与SH的反应，实验结果发现，在pH4.6的BR缓冲溶液中，NR与SH的缔合反应产物能使RRS显著增强并产生新的RRS光谱，RRS的增强与SH的浓度成正比，因此能用于痕量SH的测定。该方法快速、简便、灵敏 度高、稳定性好，检出限达25.9ng/mL。已用于眼药水中透明质酸钠的测定。 1 实验部分 1.1 仪器和试剂 RF-5301PC 荧光分光光度计(岛津公司，日本)，测定参数：狭缝宽度10 nm；TU-810紫外-可见分光光度计(岛津公司，日本)；PB-10酸度计(北京赛多利斯科学仪器有限公司)。 透明质酸钠（美国Sigma公司）μg/mL；中性红（天津市科密欧化学试剂有限公司 ）水溶液：2.1×10-4mol/L；Britton-Robinson 缓冲溶液(pH)：用0.04mol/L H3PO4, H3BO3和CH3COOH与0.2 mol/LNaOH按照一定比例混合，配成不同pH值的缓冲溶液，并用酸度计校正pH值。试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。 1.2 实验方法 在10.0 mL 比色管中，依次加入适量的SH标准溶液、0.5mLpH4.6的BR缓冲溶液、2.5mL2.1×10-4mol/LNR溶液，加水稀释至刻度，摇匀，放置10min。在荧光分光光度计上以λex＝λem 进行同步扫描，记录共振瑞利散射光谱，并于328 nm 处分别测量离子缔合物的RRS强度I 和试剂空白的RRS强度I0，ΔI＝I－I0。 2 结果与讨论 2.1 RRS 光谱 分别对试剂空白、SH溶液和复合物溶液用Δλ=0nm进行同步扫描，得到RRS光谱（见图2）从光谱图可知：单独的SH和NR的共振瑞利散射都非常微弱，但当两者反应形成复合物时，共振瑞利散射显著增强，并在328nm和605nm处产生一个清晰的散射峰。 图1体系的RRS光谱图 1—SH溶液：1μg/mL； 2—NR溶液：5.25×10-5mol/L； 3～7—SH-NR体系：CSH分别为0.5，1，1.5，2.0,2.5μg/mL 2.3 适宜的反应条件 2.2.1 溶液酸度的影响 实验结果表明，当pH值在4.3～5.2时，体系RRS强度达到最大。高于或低于此pH值范围均会导致RRS强度的降低，故本实验用pH为4.6的BR缓冲溶液为介质缓冲溶液，其最佳用量为0.5mL。 2.2.2 中性红用量的影响 试验了中性红用量的影响。当NR 的浓度为4.2×10-5mol/L～6.3×10-5mol/L时，体系的ΔI值均较大且恒定。本实验选用5.25×10-5mol/L的NR溶液。 2.2.3 体系的反应速度及其稳