06 真核生物的遗传分析.ppt

* * （4）HAT技术选择杂种细胞 如何将杂种细胞与它们的亲本细胞区别开、选择出来？ HAT technique /HAT culture medium (含Hypoxanthine-aminopterin-thymidine) 次黄嘌呤 氨基喋呤 胸腺（胸腺嘧啶脱氧核苷） 利用只有杂种细胞由于合成核苷酸的从头合成途径被氨基喋呤阻断后，可利用补救途径合成DNA（核酸），细胞能够分裂繁殖生存，而非杂种细胞因其补救途径（应急途径）被HGPRT－、TK－阻断，不能合成DNA，不进行生长而死亡，来选择杂种细胞。 * 1）DNA的生化合成途径： 在细胞中核苷酸的生物合成有两条途径：一条是从头合成的主要途径，是由糖（核糖或脱氧核糖）加氨基酸进行合成。 如果代谢拮抗物 氨基喋呤（aminopterin）存在时，则这一途径受阻。但如果细胞中有由DNA或RNA降解而来的嘌呤或嘧啶存在时，在酶的作用下，形成核苷可走第二条途径，即由核苷转化成核苷酸的补救途径（salvage pathway）。 * 胸苷激酶TK （thymidinekinase） 细胞中有两种酶： 次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 HGPRT（hypoxanthine guaninephosphoribosyltransferase） 分别由基因TK＋和HGPRT＋编码，催化补救途径的主要途径。 只有同时具有这两种酶的细胞才能进行补救途径的合成。 * 2）用小鼠的肿瘤细胞和人的成纤维细胞进行融合 ·人的细胞：基因TK＋和HGPRT―------有胸苷激酶（TK），而HGPRT有缺陷。 ·小鼠细胞：基因TK－和HGPRT＋。存在氨基喋呤时，小鼠细胞和人细胞单独都不能生长。 融合的杂种细胞能够在含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷的培养基上生长，因为发生互补。 * 即小鼠的染色体贡献一个正常的HGPRT基因，人的染色体贡献一个正常的TK基因。HAT培养基含有次黄嘌呤（嘌呤的前体）和胸苷（嘧啶的前体），因此两种酶能够合成，两条补救途径都能操作进行。 * （5）营养缺陷突变型标记系统 CHO 细胞（Chinese hamster ovary cell，中国仓鼠卵巢细胞）已产生许多营养缺陷突变型，已知在人-CHO细胞突变型杂种细胞中，人染色体也优先丢失。 这种CHO细胞突变型属于营养缺陷突变型，只要将融合细胞群培养在不含有这一突变型所需成分的培养基上，就可去除未被融合的突变型细胞。这种条件下选出的杂种细胞不仅可保留能够与CHO 细胞营养缺陷突变型发生互补的人类特异性染色体，而且还能保留其他人体染色体。利用含多条人染色体的杂种细胞更便于快速、系统地进行基因定位。 * （6）细胞学图的制作 基因定位于染色体上 在杂种细胞中人的染色体是随机丢失的，在HAT培养基上只有携带有TK＋基因的人染色体的杂种细胞才能生长，丢失TK＋基因的不能生长。分析了许多杂种细胞克隆知道，凡是能在HAT培养基上生长的杂种细胞克隆都共同具有人的第17号染色体，这表明TK基因就在人染色体17上。 * 杂种细胞系的染色体和TK活性 细胞系 人类染色体 TK活性 （1） 5，9，12，21 － （2） 3，4，17，21 ＋ （3） 5，6，14，17，22 + （4） 3，4，9，18，22 － （5） 1，2，6，7，20 － （6） 1，9，17，18，20 ＋ * G-带技术可用于严格区分鉴别染色体。不同染色体G-带的大小和位置互不相同，但每一条染色体的带型高度特化和稳定。 另一方面小鼠和人的细胞融合后，有选择的丢失人类染色体，这样，通过分析基因产物（一般是酶），结合杂种细胞中存在的是人类某号染色体，就可以把控制该酶的基因定位于某号染色体上。 * 用体细胞杂种进行基因定位有两个步骤： 第一，将某个基因定位于某一条染色体上，称为染色体定（配）位（chromosomal assignment）； 第二，将该基因定位于某一染色体的具体位置上，称为区域定（配