3.蛋白质组-1-2015课稿.ppt

凝胶色谱 是以葡聚糖凝胶等具有三维网状结构的凝胶颗粒为固定相，利用被分离物质分子大小的差异，在固定相上受到阻滞的程度不同，分子量大受阻滞小，迁移快，分子量小受阻滞大，迁移慢，从而达到分离的一种色谱方法 凝胶过滤示意图 谢 谢 * 1995年，流感嗜血杆菌；1997年，酵jiao母；1998年，线虫；2000年，果蝇；2001年，人类；2002，水稻以及后来的岭南芥和小鼠的全基因组测定都已经陆续完成，人们开始拥有了大量的基因信息，为基因组和蛋白组研究打下坚实的基础。 好处：所有被编码的蛋白都可以被预测和鉴定；遗漏的功能可以被鉴定和分析；可以 研究各个肌体中的特性和新颖性；可以进行预测和评价。 * 它是目前分辨率最高的蛋白质分离技术 * * 完整的双向凝胶电泳分析包括：样品制备、等电聚焦电泳、平衡转移、SDS、斑点染色、图像扑捉和图谱分析等步骤。 在电场中，电泳基质形成一个从正极到负极不断增大的pH梯度，由于蛋白质是两性电解质，带负电荷的蛋白质分子向正极移动，带正电荷的蛋白质分子向负极移动，当蛋白质分子运动到各自的pI处时，所带的净电荷变为零，于是停止迁移而留在该位置上。 这种不同的蛋白质分别聚集在各自的等电点处，形成一条狭窄稳定的区带而彼此分开的现象称为等电点聚焦。 * 美国伯乐公司（Bio-Rad）IPG预制胶条将 pH 梯度固定在易于操作的支撑条上，从而简化了第一维分离。 ReadyStrip? IPG 胶条是使用高纯度 IPG 单体灌制而成的，并且已经过充分的质量和性能测试，可提供凝胶到凝胶的可重复性。 ReadyStrip IPG 胶条提供广泛的 pH 梯度选择和 7 到 24 cm 的胶条长度选择，适合 Bio-Rad 垂直电泳槽和凝胶。 * 聚丙烯酰胺凝胶（PAG）是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂四甲基乙二胺(TEMED)和催化剂过硫酸铵(AP) 的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。以此凝胶作为支持介质的电泳称为PAGE。 PAGE分为连续系统和不连续系统两大类。连续系统电泳体系中缓冲液pH值与凝胶中的相同.带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。不连续系统中带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。 SDS是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键、疏水键等，破坏蛋白质分子空间结构。 强还原剂如巯基乙醇，可以断开二硫键破坏蛋白质的分子结构。 变性的蛋白质与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。 * * 可以同时直观地显示数千个蛋白质点 均匀的蛋白质点包含一种以上的蛋白质（原核生物占20%，真核生物40%） 胶内酶解过程费时、费力，难于与质谱联用实现自动化。 * 固定相：固定相是填充于色谱中的物质。它可以是固体物质,也可以是液体物质,这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附，溶解，交换等作用。 流动相：在色谱过程中，推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为流动相。 液相色谱技术：流动相以水为主要成分 * * * * * 圖 3.9? 親和層析法的各項要素： * 圖 3.8? 親和層析法的作用機理： 考染和银染的比较 用SYPRO Ruby对2D电泳后的胶染色图 2-DE图像分析 通过2-DE得到的蛋白质分离图谱，需要经过摄像或扫描转换为以像素为基础的、具有不同灰度强弱和一定边界方向的斑点电脑信号。 2-DE获得的蛋白质图谱 目前有多种图像分析软件: MelanieII (BioRad), PD Quest (BioRad), Phoretix 2D Full(Amersham Pharmacia Biotech) ImageMaster 2d Platinum 这些软件可以完成蛋白质点的识别、匹配等，具有很强的分析功能，但其缺点是需要很多的图像手工校对。 图像采集 图像加工 蛋白质斑点的检测 数据分析 凝胶匹配 2-DE图像分析软件包操作过程 双向凝胶图谱数据库 正常肝细胞和肝癌细胞的蛋白质组双向电泳差异表达谱 园点标记的点为两者的差异蛋白 数字号码为蛋白质点在参考胶中的索引号 蛋白质的胶内酶切 包括感兴趣蛋白点的挖取、含蛋白质凝胶的脱色、胶内蛋白质的酶切等过程 双向凝胶电泳的特点 1、可分离10～100 kD分子量的蛋白质 2、高灵敏度，高分辨率，较好的重复性 3、便于计算机进行图像分析处理，可与质谱分析匹配 双向凝胶电泳的局限性