3基因组作图课稿.pptVIP

遗传标记 是DNA水平上绘制现代遗传图谱的主要路标（landmark)。 采用遗传分析的方法将基因或其它DNA序列标定在染色体上，得到的线性排列图称为遗传连锁图，简称遗传图。 果蝇连锁图 Shotgun测序(1) 二、 物理图谱（physical map） 1.2 部分酶切法测定DNA片段位置 局限性： 随着DNA长度的增加和酶切位点的增多，单酶切、双酶切及部分酶切产生的条带数成比例扩大，需要对大量的片段进行比对和组装。虽可借助计算机，但是难免会产生一些大小非常接近的片段，导致电泳分辨困难。 限制性作图只能应用于较小的DNA分子，上限约50kb 染色体→酵母人工染色体（YAC）重叠群→ 筛选阳性YAC酶切→ cosmid人工染色体重叠群→阳性cosmid酶切→质粒亚克隆→限制酶作图 →计算机分析串联，获得大片段。 二、 物理图谱（physical map） 1.3 基因组限制性酶切作图的技术路线 即：基于克隆的基因组作图 YAC重叠群1000kb cosmid重叠群40kb 限制酶作图、测序分析 质粒亚 克隆 二、 物理图谱（physical map） ＋ 5 3 2 8 5 2 1.3 基因组限制性酶切作图的技术路线 YAC载体是利用酿酒酵母的染色体的复制元件构建的载体。 YAC载体必须含有以下元件：①端粒重复序列（TEL） ②着丝粒（CEN） ③自主复制序列（ARS） pYAC4 CEN4 EcoRI URA3 TEL BamHI TEL ori Apr TRP1 ARS1 YAC载体的平均装载量为600 kb， 改进的操作程序可插入1400kb的片段 酵母人工染色体（Yeast Artificial Chromosomes, YAC） 二、 物理图谱（physical map） 1.3 基因组限制性酶切作图的技术路线 cosmid，也称黏粒、柯斯载体，是人工构建的含有λ噬菌体DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。 pHC79 6400 bp Tcr λfragment cos ori Apr PstI BamHI SalI 黏粒（cosmid） 二、 物理图谱（physical map） 片段装载范围为31 - 45 kb 1.3 基因组限制性酶切作图的技术路线 质粒（plasmid） 二、 物理图谱（physical map） 分子量小，拷贝数高 操作方便 片段装载范围数百bp到10 kb 1.3 基因组限制性酶切作图的技术路线 多克隆位点 ori 复制起始点 筛选标记 Amp polylinker 二、 物理图谱（physical map） 重叠群的构建—染色体步移 1.3 基因组限制性酶切作图的技术路线 二、 物理图谱（physical map） 重叠群的构建—克隆指纹排序 一个克隆的指纹表示该克隆所具有的序列特征，可以同其他克隆产生的同类指纹相比较。 如果两个克隆的指纹有部分重叠，表明这两个克隆具有共同的区段。 指纹的类型很多，可单独使用或组合使用，如RFLP指纹，重复序列指纹，STS指纹等。 1.3 基因组限制性酶切作图的技术路线 将一组不同颜色的荧光标记探针与单个变性的染色体杂交，分辨出每种杂交信号，从而测定出各探针序列的相对位置。 探针间的位置关系提供了DNA序列与基因组图谱间的直接联系。 二、 物理图谱（physical map） 2. 荧光原位杂交（FISH）作图 （Fluorescent in Situ Hybridization ） 二、 物理图谱（physical map） 2. 荧光原位杂交（FISH）作图 二、 物理图谱（physical map） 2. 荧光原位杂交（FISH）作图 荧光原位杂交作图染色体更细长为宜 二、 物理图谱（physical map） 2. 荧光原位杂交（FISH）作图 二、 物理图谱（physical map） 限制作图与FISH作图的优缺点： 限制性作图：快速，信息详细，但不适合大基因组。 重叠群：构建程序复杂，费时费力。 原位杂交：操作困难，资料积累慢，一次实验定位的分子标记不超过3-4个。 3. 序列标记位点（STS）作图 二、 物理图谱（physical map） 3. 序列标记位点（STS）作图 序列标记位点（Sequence tagged site,STS）:指一段短的DNA序列，通常长度在200-500bp，核苷酸序列已知，在待研究的染色体或基因组中仅有1个拷贝。 因此当2个片段含有同一STS序列时，可以确认这两个片段彼此重叠。 序列标记位点作图：通过PCR和分子杂交将特定DNA序列定位在基因组染色体区段中。 两个STS出现在同一片段的机会取决于他们在基因组中的距离，彼此