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第3章 高效液相色谱分析法  High Performance Liquid Chromatography  HPLC 3-1 高效液相色谱法的特点 1 高压：一般可达150～350×105 Pa。 2. 高速：一般可达1～10 ml/min。 3. 高效：GC （1000塔板/m）；HPLC （3万塔板/m）新型固定相，使分离效率大大提高。 4.高灵敏度：如荧光检测器灵敏度可达10 g。另外，用样量小，一般几个微升。 5.适应范围宽：不受试样挥发性及热不稳定性限制 3-2 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素 GC的理论适合HPLC HPLC速率理论 2）纵向扩散 3）传质阻力项C μ A）固相传质阻力Hs= μ B）流动相中的传质阻力项 Hm= μ C）滞留流动相中的传质阻力项 Hsm = μ 提高柱效的途径及峰展宽 提高柱效 提高柱内填料的装填均匀性 减小粒度 峰展宽 柱前峰展宽：进样引起（进样器死体积及扰动）； 柱后峰展宽：检测器、流通池死体积引起。 3-3 HPLC的主要类型及分离原理 1 液- 液分配色谱法（liquid-liquid partition chromatography) 分离机理：流动相和固定相都是液体。试样在两相间进行分配。平衡时： a 正相液-液分配色谱法（normal phase liquid chromatography): 流动相的极性小于固定液的极性。 b.反相液-液分配色谱法(reverse phase liquid chromatography): 流动相的极性大于固定液的极性。 液-液分配色谱法的缺点：固定液在流动相中仍有微量溶解；流动相通过色谱柱时的机械冲击力，会造成固定液流失。 （一）常规化学键合相 利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面 1．分离机制：分配 + 吸附（以LLC为基础） 2．特点： 不易流失 热稳定性好 化学性能好 载样量大 适于梯度洗脱 （二）反相键合相固定相 1．固定相：极性小的烷基键合相 C8柱，C18柱（ODS柱） 2．流动相：极性大的甲醇-水或乙腈-水 流动相极性 固定相极性 底剂 + 有机调节剂（极性调节剂） 例：水 + 甲醇，乙腈，THF 3. 流动相极性与k的关系： 流动相极性↑，洗脱能力↓，k↑，组分tR↑ 4．出柱顺序：极性大的组分先出柱 极性小的组分后出柱 5．适用：非极性~中等极性组分 （三）正相键合相色谱 1．固定相：极性大的氰基或氨基键合相 2．流动相：极性小（同LSC） 底剂 + 有机极性调节剂 例：正己烷 + 氯仿-甲醇，氯仿-乙醇 3．流动相极性与k的关系： 流动相极性↑，洗脱能力↑，组分tR↓，k↓ 4．出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先 出柱极性大的组分后出柱 5．适用： 氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小） 分离物质也相似 氨基键合相与硅胶性质差别大，碱性 分析极性大物质、糖类等 2. 吸附色谱（液-固吸附色谱） 流动相为液体，固定相为吸附剂（如硅胶、氧化铝等）。 作用机制是：当试样进入色谱柱时，溶质分子 (X) 和溶剂分子(S)对吸附剂表面活性中心发生竞争吸附（未进样时，所有的吸附剂活性中心吸附的是S），可表示如下： Xm + nSa ====== Xa + nSm 式中：Xm--流动相中的溶质分子；Sa--固定相中的溶剂分子；Xa--固定相中的溶质分子；Sm--流动相中的溶剂分子。当吸附竞争反应达平衡时： K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa] 式中：K为吸附平衡常数。[讨论：K与保留值的关系] 3. 离子交换色谱（ion exchange Chromatgraphy IEC以离子交换剂作为固定相，离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换。 以阴离子交换剂为例，其交换过程可表示如下： X -(流动相中) + (树脂-R4N+Cl-)=== (树脂-R4N+ X-) + Cl- 当交换达平衡时： KX=[-R4N+ X-][ Cl-]/[-R4N+Cl-][ X-] 分配系数为： DX=[-R4N+ X-]/[X-]= KX [-R4N+Cl-]/[Cl-]