核酸的提取.docVIP

核酸的提取核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在，核酸提取的主要步骤为：裂解细胞去除与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子，去除其他不需要的核酸分子，如提取DNA分子时，应去除RNA，反之亦然。沉淀核酸纯化核酸，去除盐类，有机剂等杂质(一)DNA提取的经典方法 DNA提取的经典方法，即所谓的酚-氯仿提取法。因为使用两种不同的有机溶剂交替抽提更容易将蛋白除去，提取次序为酚、酚/氯仿（1：1）、氯仿，这种方法提取的DNA纯度高、片段大、效果好，缺点是较为繁琐。 说明：回收上层水相时，一定不要接触两相的界面，以免将蛋白质等物质吸入新离心管。沉淀DNA，无水乙醇是首选的有机溶剂。另：异丙醇、醋酸钠等。70%乙醇漂洗DNA，是为了去除残余的盐类，去除过量SDS和酚等杂物，因为SDS在70%的乙醇中保持溶解状态，不与DNA共沉淀，从而通过弃上清液去除这种去污剂,避免对以后PCR反应的影响。TE缓冲液：10mmol/L Tris-Hcl1mmol/L EDTA pH 8.5或 8RNA的提取 RNA提取条件较DNA要求严格，主要是因为临床标本及实验室环境中，存在大量对RNA有强烈降解作用RNase。RNase是一类生物活性非常稳定的酶类。这种酶耐酸、耐碱、耐高温，如煮沸也不能使之完全失活。蛋白质变性剂可使之暂时失活，但变性剂去除后，又可恢复活性。除细胞内RNase以外，环境中灰尘、各种实验器皿和试剂、人体的汗液及唾液中均存在RNase，因此在提取RNA时，关键要避免RNase对标本的污染及防止RNase对提取的RNA的降解。 1．提取RNA所用器皿的处理及溶液的准备塑料制品：如试管、EP管、Tip头，使用灭菌的一次性用品。玻璃用品：如烧杯、试管和其他用品，常被RNase污染，使用前必须于180oC干燥8小时以上，或用0.1轕C水(焦碳酸二乙酯)浸泡处理。DEPC是RNase的强抑制剂，作用机制是通过与蛋白质中的组氨酸结合，使蛋白质变性。37浸泡2小时，然后用灭菌水漂洗数次，于100干烤15分钟，去除器皿上残余DEPC。所需溶液的配制：必须用高压灭菌的水和RNA提取专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药匙称取试剂，把溶液装入无RNase的玻璃器皿。 严格来说，所有溶液均应用0.1轕C于37处理12小时以上，然后于100加热15分钟或高压灭菌15分钟，去除残余DEPC。2．RNA提取中RNase污染的控制最主要的潜在污染源是操作人员的手，手直接触摸之处毫无疑问会留下RNase，另外，说话带出的唾液也富含RNase，故在涉及RNA的一切操作过程中，都应戴一次性手套和口罩。 实验中，如接触了“脏的”玻璃器皿和其他物品以后，手套就可能污染RNase，因此RNA提取实验中，应勤换手套。 ?RN A提取方法下面以异硫氰酸胍结合氯仿-酚提取法介绍RNA的提取。异硫氰酸胍是一种强用力的蛋白质变性剂，能迅速溶解蛋白质，导致细胞结构破碎，核蛋白由于其二级结构的破坏消失而迅速与核酸分离。 RNase虽可耐受多种处理，（如煮沸）而不失活，但却会被4mol/L异硫氰酸胍和-β巯基乙醇（破坏RNase蛋白质中的二硫键）等还原剂所灭活，因而可从组织中分离出完整RNA分子。 因此上述试剂是制备RNA的常规试剂。 200μl血清（浆）加入200μl 20%PEG60004oC，3小时，12000rpm，4离心15分钟弃上清，加500μl裂解液（含异硫氰酸胍、-β巯基乙醇等），混匀加50μl NaAc，500μl饱和酚：氯仿：异戊醇（50：49：1），充分混匀，冰浴10分钟4℃12000rpm，离心5分钟小心吸取上层水相移至一新离心管中，避免吸取两相之间的蛋白质，用氯仿-异戊醇再抽提一次加2.5倍体积无水乙醇，冰浴30-60分钟4℃12000rpm，离心10分钟弃上清，沉淀用70%乙醇洗二次，65烘干用10μl DEPC水溶解RNA，并加2u RNasin-20℃保存备用 （三）核酸提取的其他方法(简单介绍): 胍盐提取结合二氧化硅吸附法二氧化硅具有特异吸附核酸的特性，异硫氰酸胍可使细胞裂解,因此在高浓度异硫氰酸胍存在下，从细胞(包括细菌)或病毒颗粒中释放出来的核酸成分可以结合在二氧化硅上，利用此特性可提取血液和尿液中DNA和RNA。2.TRIzol试剂提取RNA方法： TRIzol试剂盒是由GIBCO BRI公司推出的产品，其操作方法简单方便，一小时内即可完成。用TRIzol试剂裂解细胞，再加入氯仿，离心后可见三层，上层为透明的水相含有RNA，中间层含DNA，下层为红色的有机相，含蛋白质。3.旋转离心柱提取旋转离心