细胞融合实验报告.docVIP

一．实验目的 1.了解并掌握细胞融合的方法 2.了解细胞融合技术及其在生命科学中所起的作用 3.掌握化学融合法，了解电融合法及CRY-3细胞融合仪的使用 二．实验原理 两个或两个以上的细胞合并成一个双核或多核细胞的现象称为细胞融合，也称细胞杂交，在自然情况下的受精过程即属这种现象。 诱导细胞融合的主要方法有：病毒诱导融合，化学融合剂诱导融合和电融合。 1. 病毒诱导融合：有许多种类的病毒能介导细胞融合，最常用的是灭活的仙台病毒（HVJ），为RNA病毒。病毒诱导细胞融合的过程有：首先是细胞表面吸附许多病毒粒子，接着细胞发生凝集，几分钟至几十分钟后，病毒粒子从细胞表面消失，而就在这个部位邻接的细胞的细胞膜融合，胞浆相互交流，最后形成融合细胞。 2. 化学融合剂诱导融合：化学融合剂主要有高级脂肪酸衍生物、脂质体、钙离子、水溶性高分子化合物、水溶性蛋白质和多肽，其中最常用的是聚已二醇（PEG）。PEG用于细胞融合至少有两方面的作用：①可促使细胞凝结；②破坏互相接触处的细胞膜的磷脂双分子层，从而使相互接触的细胞膜之间发生融合，进而细胞质沟通，形成一个打的双核或多核融合细胞。 3. 电融合：是指细胞在电场中极化成偶极子，并沿着电力线排列成串，然后用高强度、短时程的电脉冲击穿细胞膜而导致细胞融合。 主要过程包括：制备原生质体：微生物及植物细胞有坚硬的细胞壁，需要用酶将其降解，而动物细胞无需要去壁处理。2.诱导细胞融合：两种亲本细胞的悬浮液调到一定密度，滴入高浓度的聚乙二醇（PEG）诱导融合，或用物理方法如电刺激促进融合。3.筛选杂合细胞：在特定的筛选培养基上，让杂合细胞有选择地生长，除去其他未融合的细胞。 实验中发现大部分的融合都是3个细胞的融合，两个相互融合的很少基本没有找到。图中的三个细胞可能是两个相互融合和另一个重叠或者是三个相互融合。可以清晰地看到一个连续完整的细胞膜包围的两个细胞核，另一个细胞经分析是重叠的可能性比较大。 在观察过程中观察到很多细胞重叠到一起，很像但是并不是细胞融合，因为转动细准焦螺旋可观察到细胞接触的部分有亮的细胞膜。利用通过调节细准焦螺旋能否观察到两个重叠细胞之间的细胞膜可以判定两细胞是否融合。 有些细胞没有融合可能是加入PEG时间短，没有充分发挥作用。融合温度不高也能导致融合细胞少，由于生物膜膜的流动性与温度成正比，故细胞的融合效果也与温度成正比。因此，为了获得更好的融合效果, 在细胞可能承受的温度范围内可适当提高处理的温度。