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第9章 转基因动物与动物生物反应器 Transgenic Animal ＆ Animal Bioreactor 学习须知 主要内容：动物转基因技术及其应用 重点：常用的转基因动物培育技术 难点： 章节内容 前言 9.1 转基因动物的培育技术 9.2 转基因动物的应用 9.3 动物乳腺生物反应器 前言 在基因组内稳定地整合了以实验方法导入的外源基因，并且外源基因可以稳定地遗传给后代的遗传工程动物。 或者是指借助基因工程技术把外源基因导入受体动物的染色体内，外源基因可在受体内稳定遗传的动物。 9.1 转基因动物的培育技术 常用的转基因动物培育技术有： 9.1.1 基因显微注射法 9.1.2 逆转录病毒感染法 9.1.3 胚胎干细胞介入法 9.1.4 精子载体导入法 9.1.5 YAC介导法 9.1.6 细胞核移植技术 9.1.1 基因显微注射法 原理 通过显微注射仪把外源基因直接注射到受精卵的雄性原核内部，并使之整合到基因组DNA中，获得转基因动物。 9.1.1 基因显微注射法 以转基因小鼠的培育为例： 1. 目的基因的制备与纯化； 2. 卵供体母鼠和假孕母鼠的准备； 3.供体母鼠超数排卵处理； 4. 供体母鼠与公鼠交配； 5. 受精卵采集； 6. 目的基因显微注射； 7. 受精卵移植； 8. 目的基因表达鉴定和检测； 9. 建立遗传基因小鼠近交系。 1. 目的基因的制备与纯化； 目的基因的来源： 内切酶的酶切片段； cDNA; 人工合成基因片段； PCR扩增特异片段。 2. 卵供体母鼠和假孕母鼠的准备； 将输精管结扎后绝育的雄鼠交配可育雌鼠，剌激雌鼠产生一系列一系列妊娠变化反应而得到假孕母鼠，做为受精卵转基因后的养母 。 3.供体母鼠超数排卵处理； 向可育雌鼠注射孕马血清取绒毛膜促性腺激素（PMSG）以及人绒毛膜促性腺激素(HCG)促使其超排卵。 4. 供体母鼠与公鼠交配； 超排卵处理后，供体母鼠与可育雄鼠交配。 5. 受精卵采集； 交配次日，剖腹从供体母鼠的输卵管内收集受精卵，CO2培养箱内培养液保存备用。 6. 目的基因显微注射； 用显微注射装置将目的基因溶液导入受精卵雄性原核内 。 显微注射的机理 受精卵1个小时之内，精子与卵子各自形成自己的原核，不融合，随着时间的推移，雄原核开始膨大。 注射针要插入雄原核内。首先将受精卵置于培养基的液滴内，用吸持针找到受精卵并吸持住，调整雄原核的位置。将注射针装好DNA溶液，通过调节注射管，慢慢将DNA溶液注射进入雄原核内 。 7. 受精卵移植 将已转入基因的受精卵先体外培育，从单细胞到桑葚胚阶段，自假孕母鼠的背部植入其输卵管内，使胚胎在养母体内发育成熟 。 8. 目的基因表达鉴定和检测 ①幼鼠发生断乳后自尾部提取DNA，与目的基因探针作分子杂交（southern），鉴定外源基因是否整合，有整合的鼠称为首建鼠（founder）（半合子：目的基因整合在二倍体动物的其中一条染色体上 ）； ② 检测：通过 northern (RNA) and western (Pr) 杂交在转录和蛋白质水平上检测表达。 9. 建立遗传基因小鼠近交系。 首建鼠(半合子)与正常的野生型小鼠杂交，检测后代的整合率，取后代有50%机率带有整合基因的小鼠(阳性)，近亲繁殖，再通过同一窝的阳性雌雄小鼠(兄妹)交配，在基因的同源重组作用下，最终得到纯合子小鼠。 转基因动物的一般制备过程 显微注射法优点： 外源基因的导入整合效率较高，不需要载体，直接转移目的基因，目的基因的长度可100Kb。它可以直接获得纯系，实验周期短。 显微注射法不足点： 外源基因整合的效率低，不能控制整合的位点，外源基因随机结合或随机插入位点，有插入突变的风险，而且整合的拷贝数未知，方法较复杂，技术性强，设备昂贵等，基因稳定耗时较长，效率低。 9.1.2 逆转录病毒感染法 1.原理： 将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成高浓度的病毒颗粒，人为感染着床前或着床后的胚胎，也可以直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共孵育以达到感染的目的，通过病毒将外源目的基因插入整合到宿主基因组DNA中去。 2. 流程 （1）构建逆转录病毒载体； （2）包装细胞； （3）重组病毒感染早期胚胎； （1）构建逆转录病毒载体 步骤： 病毒DNA提取； 病毒DNA克隆到载体； 外源目的基因克隆到载体。 （2）包装细胞 包装细胞是通过基因工程技术对细胞进行修饰，使其产生病毒结构基因所编码的蛋白，为逆转录病毒载体包装成为重组病毒提供全面的病毒蛋白，同时，该包装细胞并不能转录产生编码完整病毒的基因组RNA 。 载体转染包装细胞，逆转录酶催化下，载体DNA转录为RNA，包装细胞表达产生病毒蛋白，此RNA和病毒蛋白组装为具有感染性的重组病毒颗粒（位于包装细胞