第三章基因克隆载体分析.ppt

第三章 基因克隆载体 克隆载体的功能 运送外源基因高效转入受体细胞。 为外源基因提供复制能力或整合能力。 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。 1 含有允许外源DNA 片段插入的克隆位点。 2 能携带外源DNA 片段 基因 进入受体细胞，在细胞质中自我复制； 或能整合到染色体DNA、mtDNA 和cpDNA 中，随宿主DNA 同步复制。 载体分类： 1）根据构建克隆载体所用的DNA 来源分为： 质粒载体 病毒或噬菌体载体 质粒DNA与病毒或噬菌体DNA 组成的载体 质粒DNA与染色体DNA 片段组成的载体等。 第三章 基因克隆的载体 质粒克隆载体 噬菌体克隆载体 考斯质粒载体 单链DNA噬菌体克隆载体 噬菌粒载体 人工染色体克隆载体 1.1 质粒的一般生物学特性 接合型质粒 又叫自我转移型质粒。 除了带有自我复制所必需的遗传信息外还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。 如：F质粒（性质粒、或F因子）： 能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。 Col质粒 带有控制大肠杆菌素（colicin）合成的基因。 大肠杆菌素对不带Col质粒的大肠杆菌有毒。 Col质粒或R质粒如果带有转移基因，也可以成为接合型质粒。 1.1.4 质粒DNA的分离纯化 实验室一般使用下列三种方法制备： 氯化铯密度梯度离心法：质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴化乙锭污染。 沸水浴法：质粒DNA纯度底、快速、操作简便。 碱溶法：质粒DNA纯度、操作周期介于之间。 1 能自主复制，即本身是复制子 2 具有一种或多种限制酶的单一切割位点，并在此位点中插入外源基因片段，不影响本身的复制功能； 3 在基因组中有1-2个筛选标记，为寄主细胞提供易于检测的表型特征。 4 分子量要小，多拷贝，易于操作。 构建质粒载体的基本原则 选用合适的出发质粒 获得构建质粒克隆载体的元件 组装合适的选择标记基因 选用合适的启动子 提高外源DNA的容量 需要灭活出发质粒上的某些编码基因 构建过程力求简单 质粒改造的主要方法 减小体积：质粒片断酶切重排、机械破碎 减少限制性内切酶切点 便于检测的改造：离体方法、活体方法 复制特性的改造 质粒安全性的改造 性状表达的改造 pUC 18-19多克隆位点 第一， 具有较小的分子量和更高的拷贝数; 保留了pBR322的氨苄青霉素抗性基因和复制起点；控制质粒拷贝数的rop基因突变，从而使拷贝数增加，平均每个细胞500~700个拷贝。 第二，适用于组织化学检测重组体； 具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ’基因，所编码的α-肽链可参与α-互补作用，用Xgal显色对重组子进行鉴定，而pBR322质粒的重组子要进行两步的选择。 第三，具有多克隆位点MCS区段． 方便具有不同粘性末端的外源片断的插入。 1.3.4 pGEM-3Z 由pUC派生而来。 与pUC的主要区别是在MCS的两侧分别加了一个噬菌体启动子T7和SP6。 可被T7和SP6的RNA聚合酶识别转录。 质粒克隆载体的用途 用于保存和扩增片段小于2kb的目的基因。 构建基因组文库和cDNA文库。 可用于目的基因的测序。 作为核酸杂交时探针的来源。 第三章 基因克隆的载体 质粒克隆载体 噬菌体克隆载体 考斯质粒载体 单链DNA噬菌体克隆载体 噬菌粒载体 人工染色体克隆载体 2 噬菌体载体 噬菌体是一类细菌病毒的总称，英文（Bacteriophage），简称phage 。 蛋白质外壳内包裹着DNA（双链、单链、线性、环状等）。 2.1 噬菌体的一般特性 类型： 大多数呈带尾部的20面型，相当一部分为线状体型。 核酸： 核酸多数为DNA，少量为RNA，如烟草花叶病毒。 噬菌体的生活周期 分为两种：溶菌周期和溶源周期。 溶菌周期 烈性噬菌体 virulent phage 感染细菌后立即在菌体内复制和合成蛋白质外壳，重新组装成噬菌体颗粒，并导致细菌细胞解体，释放出大量子代噬菌体。 溶源周期 温和噬菌体（temperate phage 感染细菌后，将自己的DNA整合到细菌的染色体DNA中。形成这一过程称为溶源化（lysogenization 。 原噬菌体（prophage 整合到细菌染色体的噬菌体DNA称为原噬菌体，随细菌的染色体复制而复制。 1 ?DNA分子的特点 （1）长度为48502 bp； （2）双链线性DNA； （3）在两端有cos位点，可以环化。 cos位点（cohensive-end site）： ?DNA两端各有12bp的粘性末端，粘性末端形成的双链区域称为cos位点。 　?DNA进入细菌体内后，可形成双链环状DNA复制型（RF－DNA）