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mRNA差异显示技术 mRNA差异显示技术是由美国波斯顿Dena-Farber癌症研究所的Liang Peng博士和Arthur Pardee博士在1992年创立的[3]。它也称为差示反转录PCR（differential display of reverse transcriptional PCR）简称DDRT-PCR。mRNA差异显示技术是将mRNA反转录技术与PCR技术二者相互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术，具有简便、灵敏、RNA用量少、效率高、可同时检测两种或两种以上经不同处理或处于不同发育阶段的样品[4]，该方法自问世以来已被广泛用于差异表达基因的克隆鉴定研究中。其基本原理是，几乎所有的真核基因mRNA分子的3’-末端，都带有一个多聚的腺苷酸结构，即通常所说的poly(A)尾巴。因此，在RNA聚合酶的作用下，可按mRNA为模板，以oligo(dT)为引物合成出cDNA拷贝。根据mRNA分子3’-末端序列末端结构的分析可以看到，在这段poly(A)序列起点碱基之前的一个碱基，除了为A的情况之外，只能有C、G、T三种可能。根据这种序列结构特征，P. Peng等人设计合成三中不同的下游引物，它由11个或12个连续的脱氧核苷酸加上一个3’-末端锚定脱氧核苷酸组成，用5’-T11G、5’-T11C、5’-T11A表示，这样每一种此类人工合成的寡核苷酸引物都将能够把总mRNA群体的1/3分子反转录成mRNA-cDNA杂交分子。于是，采用这三种引物，可以将整个mRNA群体在cDNA水平上分成三个亚群体。然后用一个上游的随机引物和与反转录时相同的oligo(dT)引物对这个ｃＤＮＡ亚群体进行ＰＣＲ扩增，因为这个上游的引物将随机结合在cDNA上 ,因此来自不同ｍＲＮＡ的扩增产物的大小是不同的，可以在测序胶上明显分辨开来，从而筛选出不同样品间基因差异表达的DNA片段（如图1）。 随着mRNA差异显示技术的广泛应用，也逐渐显露出一些不足之处，如所得特异性cDNA片段克隆的假阳性的比例较高，差异条带分离困难，获得的差异扩增片段一般在100bp~600bp太短之间，包含大量的非编码序列，不利于同源性比较分析等。 以下是以红豆杉为例进行mＲＮＡ差异显示研究的具体操作。 图1 DDRT-PCR原理图 １实验材料 １．1红豆杉细胞 未经MJ诱导处理的A1和经MJ诱导处理的B1红豆杉细胞。 １．2寡核苷酸引物 （1）3’锚定引物： ①H-T11A(2uM): 5’-AAGCTTTTTTTTTTTA-3’ ②H-T11C(2uM): 5’-AAGCTTTTTTTTTTTC-3’ ③H-T11G(2uM): 5’-AAGCTTTTTTTTTTTG-3’ （2）5’ 随机引物： Kit引物： ①H-AP1(2uM): 5’-AAGCTTGATTGCC-3’ ②H-AP2(2uM): 5’-AAGCTTCGACTGT-3’ ③H-AP3(2uM): 5’-AAGCTTTGGTCAG-3’ ④H-AP4(2uM): 5’-AAGCTTCTCAACG-3’ ⑤H-AP5(2uM): 5’-AAGCTTAGTAGGC-3’ ⑥H-AP6(2uM): 5’-AAGCTTGCACCAT-3’ ⑦H-AP7(2uM): 5’-AAGCTTAACGAGG-3’ ⑧H-AP8(2uM): 5’-AAGCTTTTACCGC-3’ 生工引物： ①H-AP1(2uM): 5’-AAGCTTCATTCCG-3’ ②H-AP2(2uM): 5’-AAGCTTCCACGTA-3’ ③H-AP3(2uM): 5’-AAGCTTCGGGTAA-3’ ④H-AP4(2uM): 5’-AAGCTTGAGTGCT-3’ ⑤H-AP5(2uM): 5’-AAGCTTCGGCATA-3’ ⑥H-AP6(2uM): 5’-AAGCTTGGAGCTT-3’ ⑦H-AP7(2uM): 5’-AAGCTTACGCAAC-3’ ⑧H-AP8(2uM): 5’-AAGCTTTAGAGCG-3’ 特异引物： ①5ac: 5’-GAGTTTCCACCATGGTGT-3’ ②ck5: 5’- GGAGTGAGTTTCCACCAT-3’ ③10ac: 5’-TTGTTGTAGGGGTGAGTT-3’ ④10acb: 5’-CATGGTATATGTGATGGA-3’ ⑤2ben: 5’- GTTGTGGGCACAAGATTC-3’ ⑥3ben：5’- CATAGTGTATGTGATGGA-3’ ⑦Phen：5’-GGTAGTGCATGCGATGCA-3’ １．3主要试剂 （1）RNA提取 柠檬酸钠(Sodum citrate)，十二烷基肌氨