大肠杆菌的测定技术范本.pptVIP

粪大肠杆菌的测定 基本概念 基本概念 粪大肠菌群是总大肠菌群的一个亚种,直接来自粪便,除了它耐热,在44~44.5℃的高温条件仍可生长繁殖并将色氨酸代谢成吲哚处,其他特性均与总大肠菌群相同。总大肠菌群中的细菌除了生活在肠道中,在自然环境中的水与土壤中也经常存在,但这些在自然环境中生活的大肠菌群培养的最适合温度为25℃,如在37℃培养则仍可生长,但如果将培养温度上升至44.5℃则不可生长,而直接来自粪便的大肠菌群,习惯于37℃左右生长,如将培养温度升高至44.5℃仍可继续生长。因此,可用提高培养温度的方法将自然环境中的大肠菌群与粪便中的大肠菌群区分开。。 基本概念 在37℃培养生长的大肠菌群,包括粪便内生长的大肠菌群称为“总大肠菌群” 在44.5℃仍能生长的大肠菌群称为“粪大肠菌群”,粪大肠菌群细菌在卫生学上具体有重要的意义 测定方法 粪大肠菌群测定的方法有多管发酵法和滤膜法。 这里只讨论滤膜法的测定,该方法所需的仪器简单,操做简便快速,适用于地表水、地下水及废水中粪大肠杆菌的测定。 原 理 滤膜是一种微孔性薄膜。 将水样注入已灭菌的放有滤膜（孔径 0.45μm）的滤器中，经过抽滤，细菌即被截留在膜上，然后将滤膜贴于 M.FC培养基上，44.5℃温度下进行培养，计数滤膜上生长的此特性的菌落数，计算出每 1L水样中含有粪大肠菌群数。 培养基成分 胰胨 10g 蛋白胨 5g 酵母浸膏 3.0g 氯化钠 5.0g 乳糖 12.5g 胆盐三号 1.5g 1%苯胺蓝水溶液 10mL 1%玫瑰色酸溶液（溶于 0.2mol/L氢氧化钠液中） 10mL 蒸馏水 1000mL 培养基配制方法 将上述培养基中的成分（除苯胺蓝和玫瑰色酸外），置于蒸馏水中加热溶解，调节 pH为 7.4，分装于小烧瓶内，每瓶 100mL，于 115℃灭菌 20min。贮于冰箱中备用。临用前，按上述配方比例，用灭菌吸管分别加入已煮沸灭菌的 1%苯胺蓝溶液 1mL及新配制的 1%玫瑰色酸溶液（溶于 0.2mol/L氢氧化钠液中）1mL，混合均匀。加热溶解前，加入 1.2%～1.5%琼脂可制成固体培养基 测定步骤 1、水样量的选择： 水样量的选择根据细菌受检验的特征和水样中预测的细菌密度而定。 如未知水样中粪大肠菌的密度，就应按下表所列体积过滤水样，以得知水样的粪大肠杆菌密度。先估计出适合在滤膜上计数所应使用的体积，然后再取这个体积的 1/10和 10倍，分别过滤。理想的水样体积是一片滤膜上生长 20～60个粪大肠菌群菌落，总菌落数不得超过 200个。 2、滤膜及滤器的灭菌 将滤膜放入烧杯中，加入蒸馏水，置于沸水浴中煮沸灭菌三次，每次 15min。前两次煮沸后需更换水洗涤 2～3次，以除去残留溶剂。 滤器和垫圈分别用纸包好，在使用前先经 121℃高压蒸汽灭菌 30min。滤器灭菌也可用点燃的酒精棉球火焰灭菌 3 、过 滤 用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，稳妥地固定好滤器。 将适量的水样注入滤器中，加盖，开动真空泵即可抽滤除菌 4、培 养 使用 M.FC培养基。培养基含或不含琼脂，不含琼脂的培养基使用已用 M.FC培养基饱和的无菌吸收垫。将滤过水样的滤膜置于琼脂或吸收垫表面。将培养皿紧密盖好后，置于能准确恒温于 44.5℃±0.5℃的恒温培养箱或恒温水浴中，经24h±2h培养 结果的观察 粪大肠菌群菌落在 M.FC培养基上呈蓝色或蓝绿色，其他非粪大肠菌群菌落呈灰色、淡黄色或无色。正常情况下，由于温度和玫瑰酸盐试剂的选择性作用，在 M.FC培养基上很少见到非粪大肠菌菌落 必要时可将可疑菌落接种于 EC培养基上培养，44.5℃±0.5℃培养 24h±2h，如产气则证实为粪大肠菌群。 结果的计算 计数呈蓝或蓝绿色的菌落，计算出每 1L水样中的粪大肠菌群数 * * 大肠菌群是指一群在37℃培养24小时能分解乳糖产酸产气、需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。 作为粪便污染指标，有广泛的卫生学意义。 *