第4章基因组测序与序列组装分析.pptVIP

4.2 基因组测序与组装 4.2.1 一些术语 覆盖面（coverage) 是指随机测序中获得的序列总长与单倍体基因组序列总长之比，coverage 越大，遗漏的序列越少 可以用P0=e-m计算，P0为丢失的概率，m为coverage 如果m=1， P0=37% m=6, P0=0.25% m=8, P0=0.034% 要使测序的覆盖率达到99.99%，就必须使coverage达到8次以上 读序（read) 每次测序可获得的DNA序列 BAC末端序列(BAC-end sequences) 一个BAC克隆插入片段两端的已测序的序列,不包括内部序列。可用于确定BAC的排列方向以及重叠群(contig)在支架(scaffold)中的排列方向 重叠群（contig) 一群相互重叠的克隆或DNA顺序,可以是草图顺序或精确顺序(finished), 包括连续的(内部无间隙)或不连续的(内部含间隙)DNA顺序 支架（scaffold) 一组已锚定在染色体上的重叠群, 内部含间隙或不含间隙. 草图序列（draft sequence) 人类基因组测序计划定义为经Phred Q20软件认可覆盖测序克隆片段3-4倍的DNA顺序. 含间隙或无间隙, 排列方向和位置未定 完成序列（finished sequence) 序列差错率(错误碱基数)低于0.01%的DNA序列, 排列方向确定,内部不含间隙, 一般coverage 达到8-10 4.2.2克隆重叠群测序与序列组装 克隆重叠群测序又称为作图法测序(map-based sequence)或者克隆依次测序（clone-by-clone) BAC-by-BAC The mapped BAC-by-BAC shotgun sequencing strategy Major steps in BAC-by-BAC shotgun sequencing (2-4kb) 线虫基因组采用克隆重叠群法测序 4.2.3 鸟枪法测序与序列组装 鸟枪法测序 将DNA分子打断成小片段，测定每一段的序列，根据每个片段的重叠部分再组装成主体序列 可以不需要事先了解基因组信息，不需要构建遗传图或物理图，但不适合大基因组 全基因组鸟枪法测序 应用图谱帮助主要序列组装 序列的读取可以一直到单一条带不能在胶上分离的位置 可以像质粒DNA克隆载体一样操作 第四章 基因组测序与序列组装 4.1 DNA测序的方法 4.2 基因组测序与序列组装 4.3 基因组测序的其他路线 4.1 DNA测序的方法 4.1.1 Maxam-Gilbert 化学降解法 （chemical degradation method) 化学修饰DNA测序法，A.M.Maxam和W.Gilbert于1977年发明。化学降解法主要用于测定短片段DNA的序列 例如启动子测序 化学降解法测序 DNA模板有链内碱基配对时也可用化学降解法测序 化学降解法基本原理及步骤 i.首先对待测片段作末端标记，用放射性32P-磷酸基团标记链的末端之一 ii. 进行四组平行的反应：（G，A+G，C+T以及C）特异性切割 iii. 最后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影。比较G、A＋G、C＋T和C各个泳道，自下而上从自显影片上就可读出DNA序列 碱基特异的化学切割反应 碱基 特异修饰方法 G pH8.0,用硫酸二甲酯对 N7进行甲基化,使 C8-C9键对碱基裂解有特殊敏感性 A+G pH2.0 哌啶甲酸可使嘌呤环的N原子位置脱嘌呤,并因此消弱腺嘌呤和鸟嘌呤的糖苷键 C+T 肼可打开嘧啶环,后者重新环化成五元环后易除去 C 1.5mol/L NaCl存在时,可用肼除去胞嘧啶 * DNA标记与分离： 先放射性标记DNA链5端 加入二甲基亚砜DMSO,加热到90度，打开双链 电泳分离 一条链比另一条链嘌呤核苷酸多，跑得慢，称为重链 纯化一条链，分成4份，每样都用一种切割试剂处理 * G反应 加入有限的硫酸二甲酯处理，使每个多聚核苷酸上只能修饰一个G残基 加入哌啶使链断裂 哌啶首先去除修饰的嘌呤环，并在紧邻所产生的无碱基位点上游的磷酸二酯键出切割DNA * 化学降解法缺点： 试剂含有毒性 不易自动化 4.1.2 链终止法（chain termination method) 1977年Sanger等人发明了利用DNA聚合酶的双脱氧链终止原理测定核苷酸序列的方法，又称为Sanger 双脱氧测序法 此法更适合序列分析的自动化 最常用的一种测序方法，第一代测序仪采用的方法 dN