分子生物学实验基础4h课稿.ppt

分子诊断学 罗建新 第一章 序论 第一节 概述 主要内容 1.内源基因异常的检验和诊断 自身基因结构异常 基因功能异常 表达产物蛋白质结构功能异常 致病 基因调控异常 致病 如 肿瘤 遗传病 2.外源基因侵入体内检测及诊断 病原微生物 B ,V 依核心部分基因DNA, RNA不同 检测及病原学分类 如 HBV HIV等 核酸是生命的存在形式 蛋白质是生命表现形式 3. 分子诊断学与以往医学诊断的关系 DNA 遗传工程 广义: 整体水平 细胞水平 染色体水平 分子水平 狭义: 指分子水平 基因工程 基因克隆 DNA克隆 1972年 P.Berg etc首次用EcoRI切.接SV40和λphageDNA构建第一个人工DNA分子.获1981年诺贝尔化学奖 1973年 Cohens.etc用 EcoRI 切.体外 连接质粒Tc-pSC101和 Neo-R6-5导入大肠杆菌,使其具有四环素和新酶素抗性.完成第一分子克隆全过程. 　 　 重组DNA技术基本原理 　　 　 　 　　 　 　 限制性核酸内切酶作用后产生两种末端： 　 钝性末端(blunt end) 粘性末端(sticky end) 2.核酸修饰酶(1)连接酶 (2)聚合酶 　 　 三.目的基因 　　应用重组DNA技术所要分离、获得的基因(已知及未知) 1. cDNA(complementary DNA):是指经反转 录合成的，与RNA互补的单链DNA。以单链cDNA为模板，经聚合反应可合成双链cDNA。 2. 基因组DNA（genomic DNA）：是指代 表一个细胞或生物体整套遗传信息（染色体 及线粒体）的所有DNA序列。 　 　 目的基因的获取 　　1.　化学合成法 　用于已知序列，或可推导出序列的基因 2.　基因组DNA 　基因组DNA文库（genomic DNA library） 3.　cDNA 　cDNA文库（cDNA library） 4.　聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR） 　 　 基因组DNA文库 存在于转化细菌内， 由克隆载体所携带的所 有基因组DNA的集合。 简称G－文库。 　 　 cDNA文库 用细胞总mRNA 制备全套双链cDNA后， 建立的基因文库。简称 c－文库。 　　 　 　 四.基因克隆的全过程 (一) 制备目的基因 （二）克隆载体的选择 　 　 　 （三）外源基因与载体的连接 1. 粘性末端连接 　 　 　　 2. 平端连接 限制性内切酶作用产生的平端 粘端经特殊酶处理变为平端 3. 同聚物加尾连接 由末端转移酶作用，在DNA片段末端加 上同聚物序列，制造出粘性末端再连接。 4. 人工接头 由平端加上带有新的酶切位点的寡核苷 酸，再用限制酶切产生粘性末端，进行连接。 　 　 （四）重组DNA导入受体菌 　　受体菌条件：安全宿主菌 　 限制酶和重组酶缺陷 　 处于感受态 导入方式：转化(transformation) 转染（transfaction） 感染（infection） 　 　 （五）重组体的筛选 　　　重组DNA导入受体菌后，经过培 养使其大量繁殖，再设法将含有目的 基因的菌落区分鉴定出来，这一过程 即为筛选（screening）或选择（selection）。 　 　 1. 直接选择法： 　　针对载体携带某种或某些标志基因 和目的基因而设计的筛选方法。其特 点是直接测定基因或基因表型。 　 　 抗药性标记选择（插入失活法）： 将目的基因插入带ampr和tetr基因载 体的tetr基因中，则tetr基因失活。在分别 含有氨苄青霉素和含四环素的两个培养基中 培养，进行筛选。 　 　 　 　 标志补救（marker rescue） 　　若目的基因能够在宿主菌表达，且表达 产物与宿主菌的营养缺陷互补，就可利用对 营养素的依赖表型来筛选。 　 　 　 　 　 　 分子杂交法： 利用32P