精子冷冻保存.docVIP

1 几种经济贝类胚胎和精子冷冻保存的研究本研究对马氏珠母贝、近江牡蛎和华贵栉孔扇贝的性腺进行低温(4)冷冻保存。以二甲亚砜为抗冻剂对马氏珠母贝、近江牡蛎胚胎以及近江牡蛎、企鹅珍珠贝、华贵栉孔扇贝精子，进行超低温冷冻保存。本研究的目的是尝试建立贝类胚胎和精子超低温冷冻保存的基本程序。 主要研究内容为1.冷冻马氏珠母贝不同发育时期胚胎冷冻的研究：取不同发育时期的马氏珠母贝胚胎，加入抗冻保护液，经离液氮面不同高度平衡后投入LN中。经35水浴解冻胚胎，镜检观察存活率，将存活的胚胎和幼虫放入海水中培育，观察发育和存活情况；2.冷冻近江牡蛎胚胎冷冻的研究：对牡蛎胚胎进行液氮冷冻，一段时间后解冻观察牡蛎胚胎存活情况，将存活的胚胎和幼虫放入海水中继续培育，观察发育存活情况；3.企鹅珍珠贝、华贵栉孔扇贝和近江牡蛎精子冷冻的研究：取性腺发育良好的雄贝解剖，将成熟的精子加入抗冻保护液，冷冻保存一段时间后，经37～40水浴解冻，镜检存活情况，确定抗冻保护液的最佳浓度。4.马氏珠母贝、近江牡蛎和华贵栉孔扇贝雄性性腺组织的低温冷冻(4)研究：将成熟贝的雄性腺组织放入4冰箱保存一段时间后，经恢复至室温然后取精液观察其活力，并进行人工授精实验，确定其受精能力。 结果如下： 1.冷冻马氏珠母贝和近江牡蛎胚胎不同发育时期胚胎存活差别较大；各期胚胎以在液氮面中冷冻保存每隔十分钟降低十厘米，半小时之内投入液氮中冷冻保，解冻后得到胚胎存活率略高于其他两种冷冻方式。 2.得到精子冷冻存活率较高时抗冻保护液浓度：解冻后的精子，部分能够正常受精，受精卵正常发育，同步性较差。当抗冻保护液浓度为10％时，精子存活率较高。 3.4低温冷冻雄性性腺的低温耐受时间大约在两天，其活力与保存时间成线性关系，其存活的精子的受精能力与鲜精基本一致，受精卵能正常发育。 可得出以下结论：不同种生物胚胎的不同发育时期存活情况不同，随着胚胎发育，冷冻保存得到的胚胎存活率升高。各期胚胎以在液氮面中冷冻保存每个十分钟降低十厘米半小时之内投入液氮中冷冻保，解冻后得到其存活率较高；当抗冻保护液的浓度为10％时，冷冻保存几种贝类精子的存活率较高。几种贝的性腺在4下可保存两天，其存活精子受精能力不受影响。鱼类精子及胚胎超低温冷冻保存鱼类精子超低温冷冻保存研究已经在上百种鱼获得成功.但是,在数万种鱼当中,这只是其中极小的一部分.另外,目前鱼类精子冷冻保存所报道的方式方法多种多样,迫切需要建立比较规范的、相对统一的技术路线.在反复实验研究的基础上,我们建立了重要底栖经济鱼类——牙鲆(Paralichthys olivacelus)和圆斑星鲽[Verasper variegates (T S)]精子超低温冷冻保存的简便易行、效果优良、便于实际应用的技术方案.从冷冻保存前后的精子运动率检测,一直到解冻精子授精率和胚胎孵化率检测等形成了比较系统、相对规范的技术路线.在鱼类胚胎冷冻方面,首先以优化筛选低毒高效的冷冻保护稀释液为目标,对不同浓度的5种常用的冷冻保护剂在胚胎发育的正常温度(16)下对牙鲆胚胎的毒性做了检测.结果显示,凡是配合有20﹪或5﹪MeOH的混合保护剂溶液对牙鲆胚胎的低温保护作用都显著优于单一保护剂的效果,而除MeOH以外的其他4种保护剂之间的所有配合都未发现这种效果.说明在选用了一种较为理想的冷冻保护剂后,再加上一定比例的MeOH,将使冷冻保护剂溶液对牙鲆胚胎的低温保护效果显著提高.对斑马鱼(Danio rerio)胚胎进行了较长时期的冷冻保存探索.在斑马鱼胚胎的冷冻保存研究中,还对解冻后胚胎的整体结构、组织学结构和超微结构的保存情况进行了观察分析.结果显示,保存效果好的解冻胚胎在整体结构上甚至看不出任何异常.而保存效果差的解冻胚胎则出现不同程度的结构异常,包括卵壳膜破裂脱落、胚胎膨胀(腹部变粗、体节肿胀并由原来的斜向后方的排列变为接近横向排列)、卵黄囊收缩或破裂、胚体断裂、甚至整个胚胎崩溃碎裂.对准冻保存后的解冻胚胎中酯酶活性用荧光素二乙酸酯法进行了显示.结果显示,解冻胚胎中酯酶活性产物——游离并发出荧光的荧光素在荧光亮度上与正常阳性对照胚胎中的无显著差异,但用热水杀死的阴性对照胚胎中无荧光出现.解冻胚胎与正常阳性对照胚胎之间的显著差异是荧光出现了不同程度的扩散现象,扩散程度随胚胎损伤的严重程度而异,表明解冻胚胎的细胞膜结构的完整性受到不同程度的破坏.而在正常阳性对照胚胎中没有荧光的扩散现象发生,说明正常胚胎的细胞膜完整,荧光素或酯酶不能扩散到细胞外.在我们的结果中,多数解冻后结构完好的胚胎中荧光很少扩散,甚至几乎没有向外扩散,说明它们完好的形态结构并不是简单地象制作生物标本一样被固定了下来,而是细胞膜仍然保持着较好的功能.石鲽、牙鲆精子冷冻保存研究及其在人工杂交中的应用对石鲽(Kareius b