AEG―I表达对宫颈癌SiHa细胞周期的影响及相关分子机制研究.docVIP

AEG―I表达对宫颈癌SiHa细胞周期的影响及相关分子机制研究 　　摘要： 目的：探讨AEG-I表达的变化对宫颈癌SiHa细胞周期性的影响以及影响的相关分子机制。方法：使用western blotting对宫颈鳞癌组织、宫颈鳞癌SiHa细胞、以及正常宫颈组织中的AEG-1蛋白的表达进行检测，分析三组样品中的AEG-1蛋白表达差异。结果：正常宫颈组织的AEG-1蛋白表达量显著低于宫颈鳞癌组织中的蛋白表达量（Plt;0.05）;SiHa细胞中的AEG-1蛋白表达量显著高于对照细胞中AEG-1蛋白表达量（Plt;0.05）。此外，AEG-1-siRNA对SiHa细胞中AEG-1表达有显著地下调作用（Plt;0.05）;AEG-1表达的下调可以显著增加SiHa细胞在G0/G1期的数量（Plt;0.05）。且AEG-1-siRNA组细胞中cyclin D1以及CDK2等蛋白的表达显著低于对照siRNA组（Plt;0.05）。结论：AEG-1在宫颈鳞癌组织以及细胞中有较高的表达，该蛋白的高表达显著影响了SiHa的周期，使其在G0/G1期比例显著增加，该现象的分子机制可能与cyclin D1以及CDK2的表达下调有相关性。 　　关键词：星形细胞上调基因-1;宫颈癌;细胞周期;小干扰核酸;分子机制 　　宫颈癌常见为鳞状细胞癌，其是临床多发的女性生殖系统恶性肿瘤。其复发以及转移成为了导致患者死亡的重要因素之一。这个复杂的过程是由一系列基因调控系统所组成。星形细胞上调基因1（astrocyte elevated gene-1，AEG-1）最初是通过人类免疫缺陷病毒-1（HIV-1）和肿瘤坏死因子α诱导人星形细胞发现的一种新型蛋白。近年来的研究表明[1]，AEG-1与肿瘤的发生和发展密切相关，在唾液腺癌、原发性胆囊癌、卵巢癌和乳腺癌等中发现AEG-1的表达异常升高。有研究显示[2]，AEG-1在宫颈癌组织中的表达也显著高于正常组织，提示AEG-1可能在宫颈癌的发生发展中发挥重要作用，但其分子机制尚需探讨。本研究对siRNA介导的AEG-1表达沉默的SiHa细胞的周期性变化进行研究，并对其发生的分子机制进行探讨，现将结果报道如下。 　　方法： 　　1， 细胞培养以及转染：细胞培养和转染：SiHa细胞复苏后，置含5%胎牛血清的DMED培养基中。达到85%一95%细胞融合度时，以siRNA和AEG-l-siRNA转染SiHa细胞。转染后将细胞分为3组：未转染组（不作任何处理）、siRNA对照组和AEG-1-siRNA转染组。 　　2， western blotting测定蛋白表达：裂解细胞（细胞数1×107加100 μl lysis buffer），根据样品蛋白浓度，按蛋白总量50μg计算体积。SDS垂直电泳200 V 90 min，100 V湿法转膜。分别结合I抗（AEG-1抗体，cyclin D1、CDK2、β-actin抗体），4℃过夜。TBS/T清洗5 min *3遍后，结合Ⅱ抗（HRP―la-beled羊抗兔IgG，羊抗鼠IgG抗体），室温1 h，温和振荡。TBS/T振荡清洗5 min * 3遍。至暗房，加ECL显色液作用1 min，感光、洗片。实验重复三次。 　　3， 流式细胞仪检测SiHa细胞周期：收集转染后48 h的SiHa细胞（每组约1x 106个），以磷酸采用流式细胞仪检测样品DNA含量。 　　4， 统计学分析：采用SPSS17.0统计分析软件对研究数据进行统计分析，计量资料之间的比较使用t检验进行分析，统计结果以Plt;0.05为差异具有统计学意义。 　　结果： 　　正常宫颈组织的AEG-1蛋白表达量显著低于宫颈鳞癌组织中的蛋白表达量（Plt;0.05）;SiHa细胞中的AEG-1蛋白表达量显著高于对照细胞中AEG-1蛋白表达量（Plt;0.05）。具体结果如下图所示。 　　N：正常组织;T：宫颈癌组织;NC：正常细胞 　　AEG-1-siRNA对SiHa细胞中AEG-1表达有显著地下调作用（Plt;0.05），AEG-1-siRNA转染组SiHa细胞中AEG-1表达量显著低于未转染组以及对照siRNA转染组（Plt;0.05）。具体结果如下图所示。 　　AEG-1表达的下调可以显著增加SiHa细胞在G0/G1期的数量（Plt;0.05）。AEG-1-siRNA组SiHa细胞在G0/G1期的比例显著高于未转染组以及对照siRNA转染组（Plt;0.05）。AEG-1-siRNA组SiHa细胞在S期的比例显著低于未转染组以及对照siRNA转染组（Plt;0.05）。具体数据如下表所示。 　　表1，AEG-1表达量对细胞周期的影响分析 　　 　　且AEG-1-siRNA组细胞中cyclin D1以