免疫增强剂对猪瘟疫苗免疫效果的影响-具体实验方案.docVIP

具体实验方案 实验目的： 本试验采用常规白细胞计数和分类计数、淋巴细胞转化试验结合流式细胞技术、猪瘟抗体ELISA检测对不同免疫条件下的仔猪进行跟踪检测，观察其白细胞和淋巴细胞数目变化情况、淋巴细胞转化功能、CD4+和CD8+淋巴细胞亚群及IFN-γ、IL-4的动态变化状况，CSFV抗体水平变化规律，并与普通免疫组及对照组进比较，分别从细胞和分子水平评价免疫增强剂复方植物多糖稀释猪瘟疫苗的安全性及对机体细胞免疫和体液免疫的影响。 实验方案： 试验分组 取20～25日龄未注射猪瘟疫苗的猪30头，随机分为A、B、C 组。A组为强勉稀释组、B组为强勉+生理盐水稀释组、C组为生理盐水稀释组。实验方法：A组用强勉2ml稀释猪瘟细胞苗3头份；B组用生理盐水1ml稀释猪瘟细胞苗3头份，然后加入强勉1ml；C组用2ml生理盐水稀释猪瘟细胞苗3头份作为空白对照。 表1 “强勉”增强猪瘟疫苗免疫效果试验设计 组别 母源抗体 试验猪头数 试验药物 添加量 给药方法 给药时间 A + 5 强勉 2ml/3头份 稀释疫苗 在接种当日使用 - 5 强勉 2ml/3头份 稀释疫苗 在接种当日使用 B + 5 强勉+生理盐水 1ml+1ml/3头份 稀释疫苗 在接种当日使用 - 5 强勉+生理盐水 1ml+1ml/3头份 稀释疫苗 在接种当日使用 C + 5 生理盐水 2ml/3头份 稀释疫苗 在接种当日使用 - 5 生理盐水 2ml/3头份 稀释疫苗 在接种当日使用 检测指标 于注射疫苗的前3天，第3，第7天，14天，21天，60天分别采血检测。（母源抗体检测的基础条件，首免时间？） 白细胞计数及分类实验 前腔静脉无菌采血20mL，分别分为肝素抗凝血和非抗凝血两份（2 mL取血清——抗体检测），取4mL用于分离淋巴细胞作淋巴细胞转化试验、CD4+和CD8+淋巴细胞亚群及IFN-γ、IL-4的动态变化状况；3mL用于上流式细胞仪检测，剩余作白细胞计数及分类计数（通过血液分析仪白细胞计数及分类计数）。 淋巴细胞转化实验 外周血淋巴细胞制备 无菌采集肝素抗凝血样2 mL/头，加入等体积无ca2+Mg2+Hank’s液混匀，于7 mL离心管中加入2 mL淋巴细胞分离液，将稀释的血液沿管壁缓缓加到分层液上，2000r/min离心20min，,,,,猪血液离心时间根据分离情况适当延长，取出，,,,,心吸取位于第二层的白色淋巴细胞层，加入无Ca2+Mg2+Hank’s液至5mL，1000r/min离心10min，弃上清，重复洗涤两次，第四次用完全RPMI-1640洗涤淋巴细胞。弃上清，用0.5mL完全RPMI-1640重悬淋巴细胞，取0.02mL计数，同时用台盼兰染色计数活细胞应在95%以上，调整细胞浓度为5xl06个/mL，留作备用。 淋巴细胞转化检测 取调整好细胞浓度的淋巴细胞悬液，用微量移液器轻轻吹打充分混匀后，向96孔平底细胞培养板上每孔加入l00uL的细胞液，实验组每孔加入100uL50 ug/nL的PHA-P，对照组加入完全RPMI-1640，每个样品设三个重复。置5%COZ培养箱中37℃培养44h，再向各孔加入20uL MTT溶液，继续培养4h，取出后,,,,心吸净上清液，每孔加入二甲基亚飒100uL溶解细胞，微型振荡器震荡混匀，避光放置10min，以570nm波长测得OD值。 流式细胞术检测CD4+/CD3+、CD8+/CD3+： 取200uL肝素抗凝血，加入适量PBS混匀后1500r/min离心5 min，弃去上清，沉淀中加入红细胞裂解液3-4mL，充分混匀，室温放置5min，1500 r/min离心5min，重复2-3次，直到上清中见不到红色为止，再用PBS洗涤两次除去裂解液，加入适量的单克隆抗体，低速振荡混匀5s，室温避光静止45 min后，用PBS反复洗涤两次，除去多余未标记的单抗隆抗体，上流式细胞仪分析，每份血样分三份分别检测CD4+/CD3+、CD8+/CD3+.。 细胞因子分泌的检测：IFN-γ和IL-4夹心ELISA试剂盒检测，具体参照试剂盒操作指南进行严格操作。 CSFV血清抗体检测：CSFV抗体ELISA检测试剂盒检测，具体参照试剂盒操作指南进行严格操作。 实验经费预算 淋巴细胞计数及淋巴细胞转化实验所需试剂及检测费用：2200元 IFN-γ和IL-4夹心ELISA试剂盒及检测费用共计：3000元*2=6000元 CSFV抗体检测试剂盒及检测费用共计：3000元 CD4+/CD3+、CD8+/CD3+检测费及仪器使用费用共计：1800元 以上共计：13000元。 费用出资问题 药品试剂： CFSE购自Molecular Probes公司 刀豆蛋白A（ConA）、brefeldin A、皂荚素（saponin）购自Sigma公司 PE