生物化学酪蛋白讲义.docVIP

实验五 酪蛋白的制备及含量测定 一、实验目的 1.学习和掌握紫外吸收法测定蛋白质含量的原理和方法 2.学习分光光度计的原理和操作方法。 二、实验原理 牛乳中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调成4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯的酪蛋白。 蛋白质分子中含有酪氨酸、色氨酸及苯丙氨酸残基，它们的结构中具有共轭双链，对紫外光有吸收作用，其最大值在280nm波长处。在此波长附近，蛋白质溶液的光吸收值与其含量（范围是0.1~1.0mg/ml）成正比，因此，280nm的吸光度可用作蛋白质的定量测定。但不同种的蛋白质对280nm波长的光吸收强度因芳香性氨基酸残基含量的不同而有差异，因此需用同种蛋白质作对照，结果才可靠。在半定量测定和纯蛋白的定量测定时，可用280nm的光吸收法。 在分光光度计中，将不同波长的光连续地照射到一定浓度的样品溶液时，便可得到与众不同波长相对应的吸收强度。如以波长（λ）为横坐标，吸收强度（A）为纵坐标，就可绘出该物质的吸收光谱曲线。利用该曲线进行物质定性、定量的分析方法，称为分光光度法、仪器及试剂95%乙醇 配100mL 、乙醇-乙醚混合液（V:V 1:1） 配200mL 0.2mol/L NaOH　（配250mL） 0.2M pH4.7 HAC-NaAC 缓冲液（配300mL）: A液：称NaAc·3H2O 54.44克，定容至2L。 B液：称醋酸 12克，定容至1L。 取A液1770mL，B液1230mL混合即得pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液3L。 1mg/ml标准酪蛋白溶液：称取酪蛋白1克于研钵中，先用少量蒸馏水湿润后，慢慢加入0.2mol/L NaOH 4ml，充分研磨，用蒸馏水洗入100ml容量瓶中，放入水浴中煮沸15分钟，溶解后冷却，定容至100ml，保存于冰箱内Φ 9cm）、表面皿、抽真空泵、抽滤装置（布氏漏斗，抽滤瓶，圆形抽滤管，橡皮塞）、40℃水浴、通风柜、紫外分光光度计、试管 四、实验1、将20mL pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液预热至40将20mL牛奶加热至40，在搅拌下缓慢地加入20mL预热的pH4.7的醋酸-醋酸钠缓冲液用精密pH试纸调pH至4.7pH没有调至4.7，对得率有什么影响？），可见溶液变为乳白色悬浮液待悬浮液冷却至室温，4000rpm离心min，弃上清，得酪蛋白粗制品用6mL水洗脱沉淀1次，4000rpm离心min，弃上清在沉淀中加入6mL 95％乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤用乙醇-乙醚混合液洗涤沉淀1次，最后用乙醚洗涤沉淀1次，抽干将沉淀摊开在上，风干，得酪蛋白纯品准确称量，计算含量得率含量（g％）＝酪蛋白100mL牛奶×100％得率＝测得含量理论含量 ×100％2、加入0.2mol/L NaOH，再用蒸馏水洗入100ml中3ml，混匀，（以什么为对照调零？）按上述方法测定280nm波长处的光密度值，并从标准曲线上查出待测酪蛋白的浓度。 五、 1、计算酪蛋白含量20mL牛奶中含有的酪蛋白质量。并进一步计算出根据紫外吸收法得到的酪蛋白含量和得率。 3、比较等电点法制备酪蛋白量