医学分子生物学-上课用-9.基因功能的基本策略答题.pptVIP

基因敲除和 RNA 干扰 基因敲除是在基因水平将某个基因定点去除，动物整体水平。 RNA 干扰不是敲除基因，而是诱导 RNA 的特异性降解，干扰基因的表达。一般是在细胞水平。 3. dsRNA 能够诱发细胞的抗病毒反应 在哺乳动物存在干扰素相关的抗病毒体系。 dsRNA 激活 dsRNA-dependent protein kinase(PKR)，进一步诱导非序列依赖的内源性 RNA 降解。 在胚胎期细胞，上述非特异的抗病毒体系尚未形成。通过 dsRNA 可以诱导序列特异的 RNAi。 3. siRNA 与 shRNA 30bp siRNA 可以诱导 RNAi，并克服哺乳细胞的障碍。 Short hairpin RNA： 　(shRNA) 可达成稳定的基因敲除。 shRNA 表达载体系统 miRNA 表达载体系统 siRNA 设计原则 siRNA antisense 链 5’ 端稳定性较低时具有更好的效率。 必要时采用专业软件进行设计。 采用多个 siRNA 片段，并筛选其中最有效的。 有时 siRNA 的干扰效果只表现在蛋白水平。 尽可能使用较低的 siRNA 浓度，以保证其特异性。 设立补救试验可进一步确认 RNAi 与效果之间的关系。 shRNA 与 siRNA 应用的局限 在某些细胞的特定状态下，shRNA 或 siRNA 仍能够诱发细胞的抗病毒反应。 miRNA 在与其靶基因 mRNA 不完全匹配的情况下仍能够诱发 RNAi。 在有 14bp 匹配的情况下就能够诱发干扰。 siRNA 可在翻译水平发挥作用，有研究发现，它能够造成大量蛋白翻译的降低。 shRNA 与 siRNA 的比较 siRNA 应用非常方便，干扰效力往往比较高。 只能进行达成瞬时的基因表达抑制。 　在线虫和植物，siRNA 可扩增，但哺乳细胞不能。 shRNA 前期工作比较复杂。 可以进行稳定的基因表达抑制。 转基因模型是研究基因功能的主要手段 动物转基因技术 外源基因导入生物体表达。 基因打靶： 外源基因替换内源基因。 基因敲除。 基因敲入。 基因沉默： 导入特定基因，抑制内源性基因表达。 * 构建携带目的基因的载体。 外源基因导入：将目的基因通过显微注射等方法注入实验动物的受精卵或着床前的胚胎细胞中。 使目的基因整合到基因组中。 将此受精卵或着床前的胚胎细胞再植入受体动物的输卵管或子宫中。 使其发育成携带外源基因的转基因动物。 表达载体：包括启动子、增强子、报告基因等元件。 * 受精卵原核显微注射法是最常用、最经典基因转移方法。 制备超量受精卵。 DNA 显微注射。 转移注射卵到输卵管或子宫。 转基因鼠的鉴定及鼠系建立。 * 转入的基因有可能碰巧整合到具有重要功能的基因之中，干扰该基因的正常表达，影响转基因动物的正常发育和代谢。 * * 完整的动物模型可以模拟人类疾病的起始和发展，帮助了解疾病的病因和发展过程。 为测试各种可能的治疗方案提供一个统一有效的系统。 转基因动物模型提供了人类疾病的研究手段 * 基因打靶(Gene Targeting) ：通过 DNA 定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，在生物活体内研究此基因的功能。 基因敲除(gene knockout): 将某个基因定向去除。 基因敲入(gene knockin): 定向将一段基因序列替代另一段基因序列。 * * * 基因敲除是在基因水平将某个基因定点去除，动物整体水平。 RNA 干扰不是敲除基因，而是诱导 RNA 的特异性降解，干扰基因的表达。一般是在细胞水平。 * 4）精子载体法 外源 DNA 精子 卵细胞 受精卵 转基因动物 共育法 脂质体转染法 电穿孔法 DNA 精子 受精卵 DNA 卵细胞 DNA 胚胎干细胞 DNA 逆转录病毒感染 磷酸钙-DNA共沉淀法 逆转录病毒感染法 电穿孔法 四细胞胚胎 囊胚 原肠胚 转基因动物 微注射 显微注射 3. 下游—基因整合与表达检测及筛选 染色体基因水平：是否整合了外源基因以及整合的位点和拷贝数。 转录水平：转基因的 mRNA 的存在与否以及表达水平。 蛋白水平：转基因的蛋白质的表达以及功能检测。 鉴定方法 PCR Southern blot 染色体原位杂交 Northern blot RT-PCR Western blot 基因转移鼠纯合鼠系的建立 × 转基因杂合鼠 未转基因鼠 生殖系细胞中不含转入基因 生殖系细胞中含转入基因 子代多次交配可得到纯合转基因鼠系 分析动物表型与外源基因的关系，揭示外源基因的功能。 建立人类疾病的转基因动物模型。 基因产品的制备：乳腺、膀胱生物反应器。 三. 转基因动物的应用 1. 人类疾病的转基因动物模型 各