3高效液相色谱法探究.ppt

* 当毛细管长度一定时，带电离子的迁移速度与溶质离子的电荷、施加的电压、缓冲液黏度及带电离子的大小有关。 电渗流的速率约等于一般离子电泳速率的5～7倍； 各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为： v+ = ve+ veo 阳离子运动方向与电渗流一致； v- = veo-ve 阴离子运动方向与电渗流一致； v0 = veo 中性粒子运动方向与电渗流一致。 * 2. 迁移时间（保留时间） CE兼具有电化学的特性和色谱分析的特性。 V— 外加电压；L— 毛细管总长度； l — 毛细管有效长度；?= ?ep+ ?eo 。 * 3. 分离效率（塔板数） 在CE中，仅存在纵向扩散。 从上式可以看出，提高分离电压是增加分离效率的主要途径。 扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高，分离生物大分子（扩散系数小）的依据。 * 4. 分离度 影响分离度的主要因素: 工作电压V；有效淌度差。 提高毛细管电泳的分辨率有两条途径：一是通过增大分离电压来提高柱效；二是控制电渗流。 * 主要由高压电源、缓冲液池、毛细管柱、检测器及数据处理等五部分组成 。 三、高效毛细管电泳仪 1.结构流程 * 2. 主要部件 （1） 高压电源 （1）0～30 kV 稳定、连续可调的直流电源； （2）具有恒压、恒流、恒功率输出； （3）电场强度程序控制系统； （4）电压稳定性：0.1%； （5）电源极性易转换。 * （1）材料：石英，各项性能好；玻璃，光学、机械性能差。 （2）规格：内径20～75μm，外径350～400μm；长度≤1 m。 （2） 毛细管柱 * （3）缓冲液池 （4）检测器 要求：具有极高灵敏度，可柱端检测； 化学惰性，机械稳定性好。 * 四、分离模式 Separation types of CE 八种分离类型，根据试样性质不同，采用不同的分离类型；每种机理的选择性不同。 1. 毛细管区带电泳 capillary zone electrophoresis ，CZE 最基本、应用最广的分离模式 * 2 . 毛细管凝胶电泳 Capillary gel electrophoresis ，CGE 将聚丙烯酰胺或琼脂等在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，试样分子按体积（分子量）大小分离的区带电泳技术。 蛋白质、DNA等的荷/质比与分子大小无关，CZE模式很难分离，采用CGE能获得良好分离。 无胶筛分技术：采用低黏度的线性聚合物溶液代替高黏度交联聚丙烯酰胺。柱便宜，易制备。 * 1. 缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，聚集成一疏水内核，外部带负电的球形胶束。 3. 胶束电动毛细管色谱（MECC ，MEKC）micellar electrokinetic capillary chromatography 在电场力的作用下，胶束在柱中缓慢移动（准固定相）。 * 2. 电泳和电渗流的方向相反，且v电渗流 v电泳 ，带负电荷的胶束以较慢的速率向负极移动。 5. 色谱与电泳分离模式的结合。 3. 中性分子在胶束相和流动相（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长。 4. 可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围。 适合中小分子、中性化合物及药物分析的应用。 * 1. 根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术。 2. 毛细管内充有两性电解质（人工合成的具有不同等电点范围的脂肪族多氨基多羧酸混合物），当施加直流电压（6～8V）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pH梯度。 阳极端装稀磷酸溶液，阴极端装稀NaOH溶液。 4. 毛细管等电聚焦 Capillary isoelectric focusing，CIEF * 4. 聚焦：具有不同等电点的生物试样在电场力的作用下迁移，分别到达满足其等电点pH的位置时，呈电中性，停止移动，形成窄溶质带而相互分离。 3. 氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液pH有关，在酸性溶液中带正电荷，反之带负电荷。在其等电点时，呈电中性，淌度为零。 * * 1. 将两种淌度差别很大的缓冲液分别作为前导离子（充满毛细管）和尾随离子，试样离子的淌度全部位于两者之间，并以同一速率移动。 2. 负离子分析时，前导电解质的淌度大于试样中所有负离子的。所有试样都按前导离子的速率等速向阳极前进，逐渐形成各自独立的区带而分离。阴极进样，阳极检测。 5. 毛细管等速电泳 Capillary isotachophoresis ，CITP * 3. 不同离子的淌度不同，所