鸡胚培养和细胞培养.docVIP

鸡胚接种 一、鸡胚的结构 鸡胚是正在发育的活的机体，组织分化程度低，细胞代谢旺盛，适于许多人类和动物病毒的生长增殖，是常用的病毒分离培养方法之一（衣原体、立克次体的分离亦用鸡胚）。目前，鸡胚在正粘病毒、副粘病毒、痘病毒、疱疹病毒及脑炎病毒，尤其在禽类病毒的研究上应用较多。可用于病毒的分离、鉴定，抗原和疫苗制备，以及病毒性质的研究等。虽然随着组织培养技术的不断发展，不少病毒已不再用鸡胚来分离培养，但对某些病毒来说，鸡胚仍是一种不可缺少的培养手段。鸡胚培养的优点是，来源充足，价格低廉，操作简单，无需特殊设备或条件，易感病毒谱较广，对接种的病毒不产生抗体等。当然，鸡胚培养也有其缺点，即除痘斑和鸡胚死亡是特异性感染指征外，多需用第二试验系统来测定病毒存在与否；非 SPF 鸡胚，亦可能含有对某些家禽病毒的母源抗体，甚至还可能带有鸡白痢沙门氏菌、霉形体、鸡白血病等病毒。因此，用鸡胚分离培养病毒时，必须考虑这些问题。原则上应使用非免疫蛋来孵鸡胚，最好用 SPF 鸡胚。一般说来，孵育至 814 天的鸡胚最有利于病毒的生长，因为此阶段鸡胚发育日趋完善，各种脏器均已形成，已能经受接种物的适当刺激，同时胚胎细胞幼嫩，骨胳不健全，还未长出羽毛，很利于病毒在胚胎中增殖，同时也有利于收获高滴度的病毒， 14 天以后，胚胎骨骼硬化，胚皮表面羽毛渐生，已不便感染病毒，特别是已不利于收获病毒材料。在操作鸡胚时）一定要注意到这一点。 孵育至 21 天左右，羊水和尿囊液已全部被胚胎吸收，一部分卵黄陷入胚胎腹部，另一部分则仍留在体外，胚胎已发育成小鸡，破壳而出。鸡胚的基本结构如图，从图中可以看出，鸡胚的最外层为石灰质的卵壳，上有气孔供气体交换，卵壳之下为壳膜，很易与卵壳分离，其功能是使气体分子与胚胎内的液体分子在内外进行交换，因此在孵育时需要有一定的湿度和空气。如果湿度太低，鸡胚就容易脱水、引起鸡胚死亡。气流不通，鸡胚缺氧，同样会造成鸡胚死亡。鸡胚的钝头（俗称“大头”），是气室，其功能是呼吸和调节胚内压力。壳膜之下为血管丰富的绒毛尿囊膜，其外层为绒毛膜，系外胚层形成，内层为尿囊膜，系内胚层形成，两膜所夹为中胚层。由于胚胎的肺发育不完善，此时绒毛尿囊膜代行胚胎呼吸器官的作用，气体的交换是在绒毛尿囊膜的血管内通过卵壳进行的。尿囊腔是胚胎的排泄器官，内含的尿囊液初为透明液体，成分极类似于生理盐水溶液，以后则尿酸盐含量增高。尿囊液量在 11-13 日龄时最高，平均达 6 毫升左右。 羊膜是胚胎的最内层包被，系外胚层和中胚层形成，羊膜腔内含羊水，胚胎浸于其中，羊水在起初是单纯的生理盐水溶液，以后蛋白质含量增加。羊水量在 8-15 日龄时最高，平均约为 1 毫升左右。附着于胚胎上的是卵黄囊，其膜系由内胚层和中胚层形成，内包卵黄，是胚胎发育的养料。卵的尖端（俗称“小头”）是卵白，是胚胎发育晚期的养料。 二、鸡胚培养实验用器械 不鸡胚培养技术简便，但一些最基本的设备仍需具备，它们包括：孵化箱、检卵器、卵架、打孔器、镊子、酒精灯、无菌眼科镊子和剪刀、吸头、洗耳球、注射器、适用的针头、无菌试营、平皿、三角瓶、烧杯、消毒胶布、石蜡和灭菌生理盐水等。下面就一些最基本的设备作一简单介绍： 孵化箱 是给受精卵提供发育条件的设备，要求恒温恒湿。市售专用孵化箱可自动进行气体交换和翻蛋。实验室中，常用普通恒温培养箱或恒温室代替，要注意保持室内湿度和人工翻蛋。 检卵器 有市售专用检卵器，在暗室中操作。也可根据条件向行设计，用木板制成一大小为 35 × 25.5 × 15 厘米的木盒，上半层为一暗室，上方开一小孔，以便于用眼检视鸡胚，两侧开大孔以供双手伸入小暗室转动鸡胚蛋和进行标记。木盒中间有一隔板，其中间部位开一卵形圆孔，木盒下层安装有 100 瓦灯泡，待检胚蛋置于卵形孔上。开灯检查，不必在暗室中进行。 打孔器 可用剪刀代替 . 卵 架 孵育用盛放鸡胚蛋的卵盘有市售专用者，实验操作中所用卵架可用木板制成小方盒，上面开一卵形孔。 鸡胚的实验室孵育 选择实验室用鸡卵，最好用白色薄壳鸡蛋，其易于观察胚胎的生活情况。实验用卵一般不宜保存过长时间，通常保存期不应超过 10 天， 5 天以内最好。而且不宜在高温下保存，通常保存于 4~20 ℃ ，以 10 ℃ 条件下最好。适宜的孵育温度为 38~39 ℃ ，相对湿度为 45~60 ％，并注意空气流通。孵育 3 天后每天应翻卵 1~2 次，以保证气体交换均匀，发育齐全，从而避免半边发育现象的出现。孵后第四天用检卵器对鸡卵进行检视，检出未受精卵和死亡的鸡胚。经四天孵育后，未受精卵不见有鸡胚迹象，仅见模糊的卵黄暗影；受精卵则可见清晰的血管小团，其中有鸡胚迹象，较大的鸡胚可见到胚胎主动运动 ; 濒死或死亡的鸡胚则见到胚胎运动呆滞或不运动，血管昏暗、折断或