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【实验】PCR常见问题总结 作者: HYPERLINK /bbs/space.php?uid=34362 \t _blank gene121 HYPERLINK /bbs/space.php?uid=34362 \t _blank (站内联系TA) 发布: 2005-07-04 PCR产物的 HYPERLINK /cpro/ui/uijs.php?rs=1u=http%3A%2F%2Femuch%2Enet%2Fhtml%2F200507%2F103133%2Ehtmlp=baiduc=newsn=10t=tpclicked3_hcq=emuch_cprk=%B5%E7%D3%BEk0=%B5%E7%D3%BEk1=%CA%B5%D1%E9%CA%D2k2=%BA%CB%CB%E1k3=%BC%EC%B2%E2k4=%B1%F9%CF%E4k5=pcrsid=c822c87c1d107af2ch=0tu=u1615258jk=72bbc65c3f7f268acf=29fv=11stid=9urlid=0luki=6seller_id=1di=8 \t _blank 电泳检测时间一般为48h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。一.假阴性，不出现扩增条带　　PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及活性 ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。　　模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。　　酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。　　引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶 HYPERLINK /cpro/ui/uijs.php?rs=1u=http%3A%2F%2Femuch%2Enet%2Fhtml%2F200507%2F103133%2Ehtmlp=baiduc=newsn=10t=tpclicked3_hcq=emuch_cprk=%B5%E7%D3%BEk0=%B5%E7%D3%BEk1=%CA%B5%D1%E9%CA%D2k2=%BA%CB%CB%E1k3=%BC%EC%B2%E2k4=%B1%F9%CF%E4k5=pcrsid=c822c87c1d107af2ch=0tu=u1615258jk=72bbc65c3f7f268acf=29fv=11stid=9urlid=0luki=6seller_id=1di=8 \t _blank 电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放 HYPERLINK /cpro/ui/uijs.php?rs=1u=http%3A%2F%2Femuch%2Enet%2Fhtml%2F200507%2F103133%2Ehtmlp=baiduc=newsn=10t=tpclicked3_hcq=emuch_cprk=%B1%F9%CF%E4k0=%B1%F9%CF%E4k1=pcrk2=%C4%A3%B0%E5k3=%CA%D4%BC%C1k4=%C0%EB%D0%C4%B9%DCk5=%C6%F8%C8%DC%BD%BAsid=c822c87c1d107af2ch=0tu=u1615258jk=72bbc65c3f7f268acf=29fv=11stid=9urlid=0luki=10seller_id=1di=8 \t _blank 冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不 够，引物之间形成二聚体等。　　Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。　　反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研