3蛋白质20141008浅析.pptVIP

三、蛋白质的一级结构 （一）、蛋白质结构的主要层次 3、蛋白质氨基酸顺序测定的方法 4、蛋白质一级结构测定 （1）测定蛋白质分子中多肽链的数目 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质摩尔数之间的关系，即可确定多肽链的数目。 （3）二硫键的断裂 Sanger法: 在碱性条件下，DNFB与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP-多肽）。 在酸性条件下，DNP-多肽易于水解为黄色DNP-氨基酸。通过乙醚抽提分离、色谱分析可以鉴定得到的不同DNP-氨基酸。 碱性条件下，DNS与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-多肽，然后水解，得到具有很强荧光的丹磺酰-氨基酸，检测灵敏度可以达到1?10-9 mol 多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。 肼化物与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。 （5）多肽链的部分裂解 Trypsin ：只断裂Lys或Arg的羧基参与形成的肽键。R1 Lys或Arg侧链 专一性较强，水解速度快 断裂点两侧残基都是疏水性氨基酸残基，如Phe-Phe，最适pH为2。 二硫键在酸性条件下稳定，确定二硫键位置时，常用胃蛋白酶水解 木瓜蛋白酶：对Arg和Lys的羧基端肽键敏感 葡萄球菌蛋白酶（Glu蛋白酶）：在磷酸缓冲液（pH7.8）中能在Glu 残基和Asp残基的羧基端断裂肽键，在碳酸氢铵缓冲液（pH7.8）或醋酸铵缓冲液（pH4.0）中只能断裂Glu 残基羧基端的肽键 梭菌蛋白酶：专门裂解Arg残基的羧基端肽键 凝血酶：专门裂解Arg残基的羧基端肽键 菠萝蛋白酶：对Arg、Lys、Tyr、Gly的羧基端肽键敏感 胰蛋白酶 R1 Lys或Arg（专一强，水解速度快）， 糜蛋白酶R1 Phe,Trp,或Tyr（水解速度快）；Leu, Met或 His 水解速度次之 嗜热菌蛋白酶R1 Leu,Ile,Val,Met,Phe,Trp或Tyr（疏水性强的残基，水解速度快） 胃蛋白酶R1/R2 Leu,Phe,Trp,Tyr及其他疏水性残基，水解速度快） （6）肽段氨基酸序列的测定 主要有Edman化学降解法、酶解法、质谱法和气-质联用法 Edman化学降解法 偶联反应：弱碱性介质中，苯异硫氰酸酯（PTC）与肽N端氨基酸发生偶联作用，生成PTC-多肽 环化反应：在无水强酸介质如三氟乙酸中PTC-多肽环化，PTC的引入使第一个肽键的稳定性降低 断裂转化反应：最靠近PTC的肽键将发生断裂，生成苯乙内酰硫脲（PTH ）-氨基酸并从肽链上掉下来，除去N-末端氨基酸后剩下的肽链仍然是完整的 PTH-氨基酸在紫外区都有强吸收，最大吸收值在268nm处。反应液中代表N-末端残基的PTH-氨基酸，经有机溶剂抽提干燥后，可用薄层层析、HPLC进行鉴定 苯异硫氰酸酯（PTC） Edman 氨基酸顺序分析法：能够不断重复循环，将肽链Ｎ－端氨基酸残基逐一进行标记和解离,可实现自动分析 （7）肽段在多肽链中次序的决定 用两种或两种以上的方法断裂多肽样品，使成两套或几套肽段，切口彼此错位，两套肽段正好跨过切口而重叠，从而确定肽段在原多肽链中的正确位置，拼凑出整个多肽链的氨基酸序列。 （9）蛋白质测序举例 牛胰岛素的相对分子量为5700，分子中含有两条多肽链：A链含21个残基、B链含30个残基，A、B链通过两个链间二硫键连接起来，A链上还有链内二硫键 （三）蛋白质序列数据库 美国国家生物医学基金会 National Biomedical Research Foundation 主持的PIR Protein Information Resource, 蛋白质信息库或Protein Identification Resource,蛋白质鉴定库 美国政府支持的Gen Bank Gene Sequence Data Bank, 基因序列数据库 和欧洲的EMBL European Molecular Biology Laboratory Data Bank, 欧洲分子生物学实验室数据库 下面的数据是从一个八肽降解和分析得到的，其组成是Ala，Gly2， Lys，Met， Ser，Thr，Tyr ，该八肽 用溴化氰（CNBr）处理得到 （1）Ala，Gly， Lys， Thr （2） Gly， Met，Ser，Tyr 用胰蛋白酶处理得到 （1）Ala，Gly， （2） Gly，Lys，Met，Ser，Thr，Tyr， 用胰凝乳蛋白酶处理得到 （1） Gly，Tyr，（2） Ala，Gly，Lys，Met, Ser, Thr， 经分析：N-末端残基是：Gly， C-末端残基是：Gly，请确定该八肽的氨基酸顺序 用下列哪种试剂最适合完成以下工作：溴化氰、尿素、巯