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耐高温酒精酵母诱变育种的研究 王凤芹，周丽娟，谢晖，宋安东 《中国酿造》，2011，229（4），28-30 研究背景 1 研究目的 2 结果与分析 4 3 实验方法 结论 5 研究背景 目前，世界各国经济发展都面临能源供应安全和生态环境保护的双重压力，为了实现能源、环境和经济的持续协调发展，各国都在致力于可再生能源的开发和研究。燃料乙醇是可再生能源研究和应用的热点，然而目前乙醇发酵的最适发酵温度为28℃～33℃，使得发酵过程中尤其是夏天需要消耗大量的能量用于发酵醪液的冷却。应用耐高温酒精酵母进行乙醇发酵可缩短发酵周期、提高设备利用率、提高出酒率、节省能源。嗜鞣管囊酵母P-01可以利用己糖和戊糖进行全糖发酵，此外，该菌株还具有易培养、易分离、耐糠醛等有毒物质等优点。 研究目的 本研究以亚硝基胍为诱变剂，对嗜鞣管囊酵母P-01进行诱变育种，选育耐高温乙醇突变菌株，以期为工业生产提供宝贵的菌种资源。 实验材料 菌株：嗜鞣管囊酵母P-01 培养基： （1）活化培养基：木糖2 g/100mL，酵母浸膏0.3 g/100mL，蛋白胨0.5 g/100mL。固体培养基加琼脂粉2 g/100mL，pH 5.0～5.5。 （2）混合糖发酵培养基：葡萄糖4g/100mL，木糖2g/100mL，酵母浸膏0.3g/100mL，蛋白胨0.5g/100mL，尿素0.02g/100mL，磷酸氢二铵0.01g/100mL，pH5.0～5.5。 （3）TTC平板培养基： 上层：TTC 0.05g/100mL，葡萄糖0.5g/100mL，琼脂1.5g/100mL； 下层：葡萄糖1.5g/100mL，木糖0.5g/100mL，蛋白胨2g/100mL，酵母浸膏1g/100mL，琼脂2g/100mL，pH6.0～6.5。 实验方法 1.亚硝基胍(NTG)诱变 P-01接种于活化固体培养基斜面，30℃培养43h。挑取2～3环斜面菌接种到50mL液体活化培养基，30℃、150r/min培养16h。取10mL菌液5000r/min离心10min，弃上清。取10ml0.1mol/L的磷酸盐缓冲液（pH7）悬浮菌体并离心洗涤2次，最后用10mL缓冲液悬浮菌体NTG，避光处理1h后5000r/min离心10min，菌体用缓冲液离心洗涤4次，并悬浮在相同体积的磷酸盐缓冲液中。将菌液进行系列稀释并涂布于活化培养基上，38℃培养2d～3d。 实验方法 2. TTC平板初筛 NTG诱变后，在活化固体培养基上长势良好的菌落采用点种法接种于TTC下层平板，38℃培养至长出菌落，倒入10mL上层培养基，覆盖菌落，38℃避光保温2h～4h，保存颜色较深的菌株。 实验方法 3.杜氏管二级筛选 选择TTC平板显色反应中显色较深的菌种接种到液体活化培养基内进行2次活化，然后按10%接种量接种到装有杜氏管的液体活化培养基试管中，38℃静置培养72h后观察杜氏管内产气情况。 实验方法 4.混合糖发酵三级筛选 将二级筛选得到的产气多的菌种接种到活化培养基内2次活化后，按10%的接种量接种到混合糖发酵培养基内，38℃、120r/min发酵72h后测定乙醇含量。 结果与分析 1.诱导剂量选择 2.TTC平板初筛结果 3.杜氏管二级筛选结果 4.混合糖发酵三级筛选结果 结论 以亚硝基胍（NTG）作为诱导剂，对嗜鞣管囊酵母P-01进行诱变处理，对诱变后的菌种进行三个层次的筛选，得到3株在38℃下乙醇产率提高的P-01-33、P-01-70和P-01-190。