6质粒的酶切.ppt

质粒的酶切 酶切片段的回收 酶切片段的连接 亚克隆流程示意 关于限制性内切酶 1. 定义：识别双链DNA分子核苷酸序列 并加以切开 2. 来源：细菌的限制修饰系统 3. 特性：识别4 ~ 6个核苷酸序列 产生平端和粘端 4. 应用：定点切割 酶切产生的末端 （1） ———G A T↓A T C——— ———C T A↑T A G——— EcoRⅤ酶切产生平端 ———G A T PA T C——— ———C T AP T A G——— （2） ———G↓A A T T C——— ———C T T A A↑G——— EcoRⅠ酶切产生5’突出粘端 ———G PA A T T C——— ———C T T A AP G——— 3） ———C T G C A↓G——— ———G↑A C G T C——— PstⅠ酶切产生3’突出粘端 ———C T G C A PG——— ———GP A C G T C——— 酶切反应 限制性内切酶反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行。 20μl体积反应体系如下： A: 质粒（pGEM-1808 或pET21a） 0.5μg B: 10×酶切buffer 2.0μl C: HindⅢ 0.5μl D: EcoRⅠ 0.5μl E: 加ddH2O 至20μl 37℃水浴消化1小时。 质粒的酶切电泳 琼脂糖冻融法回收、纯化DNA片段 1. 在紫外灯下仔细切下含所需DNA片段的胶条（小于0.6g） 捣碎，置于1.5ml离心管中。 2. 加入等体积的Tris-Cl饱和酚（pH 7.6），振荡混匀； -20℃放置5-10min待结冻； 3. 10000rpm×5min，上层液转移置另一离心管中； 4. 原管加入1/4体积H2O于含胶的离心管中，振荡混匀； -20℃放置5-10min待结冻； 5. 10000rpm×5min，合并上清液； 6. 用等体积酚/氯仿抽提2次、氯仿抽提1次， 取上清于新微量离心管； 7. 加入1/10体积3M NaAc（pH 5.2），2.5倍体积预冷的 无水乙醇，-20℃，放置30min（或过夜）； 8. 13000rpm×10min，弃上清；75%乙醇洗沉淀1-2次，晾干； 9. 适量H2O或TE溶解；电泳检测。 关于连接酶 定义：ATP存在下，在3’OH和5’ P之 间形成磷酸二酯键。 特性：连接粘端的效率远高于平端。 策略： 1.首选不匹配粘端 2.次选匹配粘端，载体脱磷 3.平端连接，提高酶量 DNA片段的连接反应 连接反应一般在灭菌的0.5ml离心管中进行 1. 10μl体积反应体系中：取载体50-100ng，加入一 定比例的外源DNA 分子（一般线性载体DNA分子与外源DNA分子摩尔数为1∶1-1∶5），补ddH2O 至8μl。 2. 轻轻混匀，稍加离心，置56℃ 5min， 迅速转入冰浴。 4. 加入含ATP的10×Buffer 1μl。 5. T4 DNA连接酶1μl。 6. 稍加离心,14-16℃连接8-14hr。 T-A连接 * * 限制性内切酶的定义、命名 1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶； 狭义指II型限制酶。 2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。 　例如：HindⅢ　　前三个字母来自于菌种名称H. influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。 EcoRI—Escherichia coli RI HindⅢ—Haemophilus influensae d Ⅲ SacI II —Streptomyces achromagenes I Ⅱ 酶切示意图 EcoR Ⅰ EcoR Ⅰ EcoR Ⅰ EcoR Ⅰ pGEM-NGF NGF NGF 酶切 pGEM载体 EcoR Ⅰ EcoR Ⅰ 不匹配粘端连接图示 匹配粘端连接图示 平端连接图示