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DNA限制性内切酶消化酶切 DNA restriction enzyme digestion 实验原理 核酸限制性内切酶是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，它们的功能犹似高等功物的免疫系统， 用于抗击外来DNA的侵袭。 限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。 限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键， 产生的DNA片段5’端为P，3’端为OH。 Ⅱ类限制性内切酶 Ⅱ型酶就是通常指的DNA限制性内切酶. Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为4～6个碱基对的反转重复顺序； Ⅱ型内切酶切割双链DNA产生3种不同的切口－－5’端突出；3’端突出和平末端。 在对称轴处切割, 产生平末端的DNA片段(如SmaⅠ: 5‘-CCC↓GGG-3’)； 在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA片段称粘性末端，如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。 5…G↓AATTC…3 →5… G AATTC…3‘ 3…CTTAA↑G …5 →3… CTTAA G…5 酶切反应中应注意的问题 内切酶： 不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶的污染； 注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端； 内切酶的用量 根据内切酶单位和DNA用量而定，通常 1U指在适当条件下，1小时内完全酶解１ug特定DNA底物所需要的限制性内切酶量，使用中一般以１ug DNA对２－３u酶短时间为宜。 同时内切酶体积不能超过反应体系10％，因内切酶中含50％甘油，体系中甘油超过5％会抑制内切酶活力； 内切酶操作应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中对内切酶的污染。 酶切反应中应注意的问题 DNA 作为内切酶底物， DNA应该具备一定的纯度，其溶液中不能含酚、氯仿、乙醚、SDS、EDTA、高盐浓度、酒精等，这些因素的存在均不同程度影响限制性内切酶的活力。 这种抑制可通过： 增加酶作用单位数（10~20U/ug DNA）、增大反应体积以稀释可能的抑制剂或延长反应时间加以克服。 酶切反应中应注意的问题 反应缓冲液： 反应缓冲液主要由Tris·HCl、NaCl、Mg2+组成，其中Mg2+为内切酶辅基； Tris·HCl维持反应体系pH值在7.2-7.6之间； NaCl浓度不同形成３种级别的离子强度： 低盐（10mM NaCl) 中盐（50mM NaCl） 高盐（100mM NaCl） 不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。 酶切反应中应注意的问题 酶解温度与时间： 大多数限制酶反应温度为37℃，如EcoRⅠ, HindⅢ, BamHⅠ, PstⅠ等，也有如BclⅠ需在50℃下进行反应， 反应时间根据酶的单位与ＤＮＡ用量之比来定，原则是酶：ＤＮＡ=2－3：1 2小时即可，充分酶解。 二、实验试剂 限制性内切酶(EcoR I) DNA（质粒DNA,插入片断1200bp） 10×H buffer: 500mM Tris HCl pH7.5 100mM MgCl2 1000mM NaCl 10mM Dithiothreitol 二硫苏糖醇; DTT 无菌水 三．实验方法 按下表分别加入各试剂（注意限制性内切酶最后加入且在冰上操作）于Eppendorf管中。 DNA 1.0 uL 10×H buffer 1.0 uL 无菌水 内切酶 0.5 uL 总体积： 10.0 uL ２．将反应体系充分混匀，并于台式离心机上短暂离心。 ３．Eppendorf管封上封口膜于37℃水管中反应2小时。 ４．反应结束后加入EDTA至终浓度10mM终止反应。 ５．取10uL反应液加2uL Loading buffer混匀于0.8％琼脂糖凝胶上40伏电泳2-3小时。 ６．紫外透射仪上检查实验结果。 四．结果与分析 记录紫外透射仪上观察到的结果。 分析实验结果的成因。 问题与讨论： 在整个酶切反应过程中应注意哪些问题？ 如何选择ＤＮＡ和限制性内切酶的用量？ 反应体系中为何内切酶用量不能超过整个反应体系的10％？ 实验仪器 电泳检测示例 实验注意事项 限制性内切酶用量可按标准体系1μg DNA加1单位酶，消化1-2h。但要完全酶解则必须增加酶的用量，一般增加2-3倍，甚至更多，反应时间也要适当延长。 酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成分会干扰酶反应。 许多实验制备的DNA不易于降解，需适当增加酶的使用量。反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。 市场