Ssp DnaB蛋白介导的精氨酸激酶N末端和C末端结构域的表达与纯化.pptVIP

LOGO Ssp DnaB蛋白介导的精氨酸激酶N末端和C末端结构域的表达与纯化 背景介绍 1. 实验设计思路 2. 实验结果与分析 3. 后续实验展望 4. 主要内容 1.1 精氨酸激酶简介 精氨酸激酶（AK）是无脊椎动物能量代谢中的一种重要磷酸激酶，它能够催化ATP的产生，是由一个小的α-螺旋组成的N端结构域和一个大的C端结构域组成。C端结构域为8股反平行β-折叠被7个α-螺旋包绕着。精氨酸激酶的结合部位主要位于C端结构域，活性催化部位则全部位于C端结构域。 From Genfa Zhou AK的N端结构域与C端结构域在折叠的过程中的相互关系到目前还没有明确的论述，两个结构域在各自折叠时折叠的先后顺序，有无相互作用，以及作用的机制，是本文的研究目标。 From Genfa Zhou 蛋白质内含子(intein)是一类具有自我剪切功能的多肽，它能将自身从前体蛋白中切出并催化其两侧的肽链之间形成肽键。 Ssp DnaB是一种小型蛋白质内含子。近年来越来越多地被应用于多肽融合标签技术以获取小肽药物（如 人脑纳素、抗病毒多肽、抗肿瘤多肽）。该方法成本低、效率高，无需采用蛋白水解酶或化学水解试剂就可得到传统方法难以获得的小型蛋白质或多肽。 1.2 蛋白质内含子简介 1.2 Ssp DnaB 蛋白质内含子简介 1.3 研究意义 蛋白质折叠问题的研究具有重要的生物学意义: 一是可以大大加快对蛋白质空间结构的认识；二是能对恢复无活性蛋白质的活性起到很好的指导作用；三是能指导新药物、新蛋白的研制；四是能帮助认识相关疾病的治病机理，并为寻找有效的治病方法提供理论指导。 精氨酸激酶的折叠机制还尚未完全阐明，本课题通过对精氨酸激酶两个结构域的折叠机制进行研究，进一步阐明精氨酸激酶的整个折叠过程，有利于更深刻地掌握精氨酸激酶结构、性质以及功能之间的相互关系，对了解一般蛋白质折叠机制具有重要的借鉴意义。 2.实验设计思路 由于AK的两个结构域尤其是N端多肽难以用常规的诱导表达方法得到，并且疏水性较强，因此本课题采用融合蛋白表达的方法获得目的蛋白，利用蛋白质内含子自我剪切的特性，可以不借助任何内切酶而得到AK的N端和C端，进而分别研究N端和C端的独立折叠以及相互作用的机制。 ? 整体思路图解 图 1 以AK基因为模板形成的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳 500bp 300bp M 1 2 3 3. 实验结果与分析 700bp 900bp 1：以AK基因为模板经PCR扩增得到的N端产物 2：以AK基因为模板经PCR扩增得到的C端产物 3：水对照 N端PCR条件： C端PCR条件： 变性：94℃ 变性：94 ℃ 退火：57℃ 退火：60 ℃ 延伸：72℃ 延伸：72 ℃ 循环次数：35 循环次数： 35 AK-N UP ：GGTGCTCTTCCAACATGGCTGACGCTGCTGTTA SapI AK-N Down：GGTCTGCAGTTAGGTCTGCTTGAAGCCAACATG PstI AK-C UP ：GGTGCTCTTCCAACGACAAGCACCCCAACAA SapI AK-C Down：CGCGGATCCTTACATCTCCTTCTCAATCTTGATG BamHI 1 2 3 图 2 载体质粒pTWIN1经双酶切后的的琼脂糖凝胶电泳 1：质粒pTWIN1 2：质粒pTWIN1经 SapI/PstI 双酶切 3：质粒pTWIN1经 SapI/BamHI 双酶切 图3 以质粒pTWIN1/N-terminus和质粒pTWIN1/C-terminus 为模板形成的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳 500bp 300bp 700bp 900bp M 1 2 3 1：以 pTWIN1/N-terminus为模板 2：以 pTWIN1/C-terminus为模板 3：水对照 AK-N UP ：GGTGCTCTTCCAACATGGCTGACGCTGCTGTTA SapI AK-N Down：GG