干扰睾丸Clock基因对小鼠体外受精的影响.docVIP

干扰睾丸Clock基因对小鼠体外受精的影响 　　【摘 要】目的：研究雄鼠睾丸Clock基因沉默后，小鼠体外受精的变化及机制。方法：通过在ICR小鼠睾丸内注射Clock干扰质粒（实验组）和HK阴性对照质粒（对照组），注射18天后收集雄鼠精子，计数精子浓度，前向运动精子百分率和精子总活率。再将孵育好的精子加入卵培养皿中，分别观察卵丘颗粒细胞驱散情况及卵裂情况，计算受精率、囊胚生成百分率和胚胎孵化率。结果：睾丸Clock基因沉默后，小鼠精子活动率及前向运动率较对照组降低（p0.05），实验组精子驱散卵丘颗粒细胞能力的时间延长（p0.001）。结论：睾丸clock基因可影响精子驱散卵丘颗粒细胞的能力，该机制在Clock基因影响小鼠生殖的过程中的作用有待进一步研究。 　　【关键词】Clock基因；精子；体外受精；前向运动；受精率 　　0 引言 　　近日节律在生物的生殖和发育过程中发挥重要作用[1]。Clock基因是近日节律系统的核心成分，它在哺乳动物的生殖器官有表达，如子宫[2]，输卵管[3]和睾丸[4]等。研究发现Clock基因突变可引起动物生殖能力变化，如L.M.Beaver等发现果蝇睾丸和精囊中的精子数量下降，雄性生育能力降低[5]。通过前期研究，我们发现干扰睾丸Clock基因的表达引起小鼠胎仔数下降[6]，小鼠的生殖能力降低[7]。但Clock基因引起其生殖能力下降这一现象的机制一直未明了，本研究通过向小鼠睾丸注射Clock干扰质粒沉默Clock基因，观察精子运动和体外受精的变化，以进一步探究Clock基因影响小鼠生殖的机制[8]。 　　1 材料和试剂 　　1.1 实验动物 　　实验中雄性ICR小鼠8-10周，雌性ICR小鼠4-6周，均饲养于光暗各12h的循环箱内，自由进食和饮水；将雄性小鼠20只随机分为实验组和对照组2组，每组10只，实验组在睾丸内注射Clock干扰质粒，对照组在睾丸内注射HK阴性质粒。雌鼠10只，每组5只（雌雄比，雌：雄=1：2）。雌雄分开饲养。 　　1.2 试剂 　　质粒：Clock干扰质粒（武汉晶赛公司）；HK阴性对照质粒（武汉晶赛公司）；OMEGA质粒提取试剂盒；孕马血清促性腺激素（PMSG）；绒毛膜促性腺激素（HCG）；HTF培养液；HEPES-HTF培养液；卵裂培养液；囊胚培养液；血清蛋白代用品（SPS）；动物体内转染试剂In vivo-jetPEITM（Poly Plus）。 　　2 实验设计 　　2.1 实验处理 　　雄性小鼠乙醚麻醉。实验组：用微量注射器将20μlClock干扰质粒注射入小鼠的双侧睾丸里。对照组：用微量注射器将20μlHK阴性对照质粒注射入小鼠的双侧睾丸里。注射质粒18天后，手术法收集精子并孵育精子。向雌鼠体内腹腔注射PMSG 10IU/只，同等条件下培养观察两天之后，再次向雌鼠体内腹腔注射HCG 10IU/只，培养并观察15-16h，用颈脱臼法处死小鼠。配置卵培养液待用。再将孵育好的精子浓度约为1×106/ml精子加入卵培养皿中进行体外受精及胚胎发育的观察。 　　2.2 结果观察 　　我们在注射质粒后的18天，将收集到雄鼠精子统计分析并计算其精子浓度。精子因为运动方式的不同，可分为三个等级：前向运动（A级：快速前向直线运动和B级：直线运动）、非前向运动（C级：曲线运动和D级：原地打转）、不动。针对不同视野的200个精子按照运动方式进行分级，计算前向运动精子百分率和精子活动率，以此来观察和分析精子的活动度的变化。前向运动精子百分率=前向运动精子数/200×100%；精子活动率=（前向运动精子数+非前向运动精子数）/200×100%。 　　通过计算受精率、囊胚形成率和胚胎孵化率来观察ICR小鼠体外受精及胚胎发育的情况。按如下方法进行计算：受精率=卵裂胚数/卵丘-卵母细胞复合体数×100%；囊胚形成率=囊胚数/卵裂胚数×100%；胚胎孵化率=孵出胚胎数/囊胚总数×100%。 　　2.3 统计分析 　　实验数据以平均值±标准差（x±s）表示，组间均数的比较用t检验，率的比较采用Χ2检验。本研究数据均采用SPSS12.0统计软件进行分析。 　　3 实验结果 　　3.1 精子活动度 　　实验结果如表1，实验组和对照组的精子浓度分别为（16.77±7.65）×106/ml、（18.76±10.37）×106/ml，两组精子浓度无明显差异（P0.05）。 　　表1 干扰小鼠睾丸Clock基因后精子的活动度 　　注：*与对照组相比，p0.05. 　　实验组前向运动精子百分率为（36.09±7.54）%，精子活动率为（62.83±8.20）%；对照组前向运动精子百分率为（42.00±8.02）%，精子活动率为（69.44±9.47）%，两组差