百脉根高频再生体系建立和猪瘟病毒E2基因的遗传转化.docVIP

百脉根高频再生体系建立和猪瘟病毒E2基因的遗传转化 　　摘要：在建立百脉根（Lotus corniculatus L .）高频再生体系的基础上，通过农杆菌介导，将猪瘟病毒（CSFV）表面抗原E2基因转化进入百脉根，获得转基因阳性株系5个。并对遗传转化体系中关键性因素进行优化，结果表明，最优化体系为子叶预培养3 d后，用OD600nm为0.5±0.05的菌液侵染30 min，共培养3 d并添加AS（乙酰丁香酮），选择培养基中卡那霉素浓度为50 mg/L，可获得理想的转化效率。为抗猪瘟可食性疫苗的研制奠定基础。 　　关键词：百脉根（Lotus corniculatus L .）；高频再生；遗传转化 　　中图分类号：Q78文献标识码：A文章编号：0439-8114（2014）10-2368-05 　　Establishing Regeneration System of Lotus corniculatus L. with High Frequency and Genetic Transformation of CSFV E2 Gene 　　JIA Yong-hong，SUN Yan-xiang，ZHANG Jiang-li，FENG Xue，YUAN Xiao-yuan，ZHANG Bing 　　（College of Life Science，Langfang Normal College，Langfang 065000，Hebei，China） 　　Abstract： Based on the established regeneration system of Lotus corniculatus L. with high frequency and mediated by Agrobacterium tumefaciens，5 lines of transgenic Lotus corniculatus L. with E2 gene of classical swine fever virus（CSFV） were obtained. Several key factors affecting genetic transferring system were optimized during E2 genetic transformation. The results showed that the optimal system was pre-cultivated cotyledon for 3 days and infected with Agrobacterium at the concentration of OD600nm=0.5±0.05 about 30 min. After co-cultured for 3 days， 100 μmol/L AS was added in culture medium containing 50 mg/L Kanamycin. Under this system， ideal efficiency of genetic transformation was achieved. It will lay a foundation for edible vaccine of resisting swine fever. 　　Key words： Lotus corniculatus L.；high frequency regeneration；genetic transformation 　　基金项目：廊坊师范学院自然科学基金项目（LSZY201105）；廊坊师范学院大学生创新创业训练计划项目（201310100007）；廊坊师范学院生命科学学院“本科生参与研究性项目”（SKCYZ201302） 　　百脉根（Lotus corniculatus L.）是世界上广泛栽培的多年生优良豆科牧草之一，在水土保持和牧场改良等方面也有独特的作用。百脉根细胞全能性强，容易获得高频再生植株，遗传转化率相对较高、转基因植株生长速度快[1，2]，是植物转基因和生物固氮机理等研究的良好材料。近年来植物作为生物外源蛋白的天然生物反应器生产可食性疫苗和植物抗体的研究已取得了可喜的进展，引导着国际疫苗研制开发的新潮流[3-5]，而E2基因作为外源基因研制抗猪瘟转基因疫苗尚属有限[6，7]，本研究以猪瘟病毒表面抗原E2基因为外源基因，以农杆菌介导方法实施百脉根为转基因受体的遗传转化，以期为抗猪瘟转基因可食性疫苗的研制提供参考方案。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　1.1.1植物材料供试百脉根：暖季型，购至上海春茵种业有限公司。含E2外源基因的根癌农杆菌菌株EHA10