质粒DNA提取资料.pptVIP

1.过夜培养细菌的时间不是越长越好，而是让细菌在进入平台生长期之前收集，经验是12h-16h 2.重复一次的原因是保证提取足够的质粒DNA，在乙醇沉淀后可以在ep管底部看到DNA沉淀 3.去除培养液，可以把ep管倒扣在干净卫生纸上 4.solII配置后使用之前保证是室温，为了不让SDS析出，加入后放冰上，为了不过度裂解细菌和变性DNA（过度碱处理会把环形质粒DNA水解成线性DNA），以及为后续SDS析出做准备 5.solIII预冷，加入后放冰上，为了让SDS-蛋白有效形成复合物一同形成絮状沉淀 * 6.加入酚氯仿目前是进一步去除上清中的蛋白和脂类，需要颠倒混匀，充分使酚氯仿和溶液混合 但是必须注意在离心后转移水相上清的时候宁可损失一部分溶液也不能把酚氯仿吸入，酚氯仿污染对后续质粒DNA酶切和pcr反应是不利的 7.70%乙醇去除少量的盐和蛋白 8.离心后再ep管底部有沉淀的部位用记号笔画圈标记出来，干燥后透明不便于识别 * 质粒DNA提取 碱裂解法 实验目的 实验原理 实验仪器、材料与试剂 实验步骤 实验结果及讨论 实验目的 了解碱裂解法提取质粒的原理； 掌握碱裂解法提取质粒的方法。 实验原理 质粒：是一种细菌染色体外的、具有自主复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小型DNA分子。 碱裂解法提取质粒：是实验室常用的制备质粒的方法。这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。 载体 基因工程中，携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的工具称为载体，主要有大肠杆菌中的质粒、λ噬菌体、M13噬菌体、噬菌粒等 作为基因工程用的载体必须具备以下条件： 起始复制子 有一个或多个利于检测的遗传表型 有一系列限制性内切酶的单一识别位点（多克隆位点） 适当的拷贝数 基本结构的三大要素： 多克隆位点 选择标记（耐药性，LacZ） 独立的复制子 种类： 质粒 噬菌体 酵母人工染色体（YAC） 反转录病毒载体 表达载体等 质粒 质粒是基因工程中常用的载体之一，是染色体外小型双链环状DNA，大小在1～200kb之间，存在于细菌、放线菌、真菌以及一些植物细胞中，在细菌中最多。 T-载体 在碱性条件（pH 12.5）下，细菌的线性染色体DNA的双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的氢键虽然断裂但两条互补链彼此缠绕，紧密结合在一起。当加入乙酸钾恢复至中性时，染色体DNA分子难以复性，而质粒DNA分子很快复性，离心时染色体DNA、细菌碎片、蛋白-SDS一起被沉淀下来，而质粒DNA则留在上清液中。 RNA通过胰RNA酶A水解 用乙醇沉淀并洗涤，可得到较纯的质粒DNA。 碱裂解法原理 实验仪器、材料与试剂 （一） 仪器 1. 恒温摇床 ：培养细菌使质粒扩增 2. 超净工作台 ：在培养基中接种细菌 3. 高压灭菌锅 ：防止其它细菌的污染 4. 台式离心机 ：沉淀细菌、分离质粒与细菌DNA以及蛋白、乙醇沉淀质粒DNA 5. 微量移液器：吸取一定体积的溶液 （二） 材料 含pGEXP-4T质粒的大肠杆菌 DH 5α。 —已转化 含重组质粒的大肠杆菌 DH 5α。 —已培养 （三） 试剂 LB液体培养基 胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5 g NaCl 10 g 加去离子水至800ml 搅拌，使溶质完全溶解，用NaOH调节pH值至7.0，加入去 离子水至总体积为1升，高压蒸汽灭菌20 分钟。 LB固体培养基 在上述LB液体培养基（1L）中加入琼脂粉15g。 1.过夜培养细菌的时间不是越长越好，而是让细菌在进入平台生长期之前收集，经验是12h-16h 2.重复一次的原因是保证提取足够的质粒DNA，在乙醇沉淀后可以在ep管底部看到DNA沉淀 3.去除培养液，可以把ep管倒扣在干净卫生纸上 4.solII配置后使用之前保证是室温，为了不让SDS析出，加入后放冰上，为了不过度裂解细菌和变性DNA（过度碱处理会把环形质粒DNA水解成线性DNA），以及为后续SDS析出做准备 5.solIII预冷，加入后放冰上，为了让SDS-蛋白有效形成复合物一同形成絮状沉淀 * 6.加入酚氯仿目前是进一步去除上清中的蛋白和脂类，需要颠倒混匀，充分使酚氯仿和溶液混合 但是必须注意在离心后转移水相上清的时候宁可损失一部分溶液也不能把酚氯仿吸入，酚氯仿污染对后续质粒DNA酶切和pcr反应是不利的 7.70%乙醇去除少量的盐和蛋白 8.离心后再ep管底部有沉淀的部位用记号笔画圈标记出来，干燥后透明不便于识别 *