实验四RT-PCR详解.pptVIP

* 实验四 RT-PCR * 了解植物18SrRNA的特点，学会使用PCR进行反转录获得cDNA技术，学习和掌握RT-PCR的实验技术和实验原理。 一、实验目的 二、实验原理 RT-PCR为反转录RCR（reverse transcription PCR）的缩写，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。 由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）来完成。随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶 H降解，留下互补DNA。 二、实验原理 RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。（检测基因表达的方法，参见Northern Blot法。 RT-PCR的关键步骤在是RNA的反转录，要求RNA模版为完整的且不含DNA、蛋白质等杂质。常用的反转录酶有两种，即鸟类成髓细胞性白细胞病毒（avian myeloblastosis virus,AMV）反转录酶和莫罗尼鼠类白血病病毒（moloney murine leukemia vrius,MMLV）反转录酶。 * 三、仪器和试剂 1、仪器： PCR仪、高速冷冻离心机、微波炉、稳压电源、水平电泳槽、凝胶成像系统。 2、材料与试剂： HiFiScript快速去基因组cDNA第一链合成试剂盒 18SrRNA扩增引物序列为(5–3)： L：CTTCTTAGAGGGACTATGGC R：TACGGAAACCTTGTTACGAC * 四、实验步骤 1、去除基因组DNA反应 在0.2mL无RNA酶的PCR管中加入以下试剂： 短暂离心，混匀体系中组份。 42℃反应2min。短暂离心，置于冰上冷却。 10×gDNA Eraser Buffer 1uL gDNA Eraser 1uL RNA 8uL * 四、实验步骤 2、逆转录反应 向步骤1反应液中加入以下试剂： 短暂离心，混匀体系中组份。 42℃反应30min，85℃反应5min。 短暂离心，置于冰上冷却。 HiFiScript 1uL Primer Mix 1uL 5×RT Buffer 4uL RNase-Free Water 4uL * 四、实验步骤 3、18SrRNA扩增： 在新的0.2mL PCR管中加入以下试剂： 短暂离心，混匀体系中组份。 Buffer 2.5uL dNTPs 0.5uL 引物L 0.5uL 引物R 0.5uL TaqE 0.5uL ddH2O 18.5uL 上述反应液 2uL * 四、实验步骤 3、18SrRNA扩增： 在PCR仪中设置反应程序： 94℃反应5min 94℃ 30S 54℃ 30S 30次 72℃ 30S 72℃ 10min 4℃ 5min * 四、实验步骤 4、PCR产物电泳检测 （1）1%琼脂糖凝胶：称取0.2g琼脂糖，加入20mL 1×TAE缓冲液，在微波炉中加热，反复加热、振荡2-3次，使琼脂糖充分融化。待凝胶冷却至60℃左右，倒入插入梳子的凝胶板中（避免产生气泡），让凝胶自然凝固。 （2）待凝胶凝固后，小心拔出梳子，避免前后左右摇晃，以免破坏胶面及加样孔，小心将凝胶和胶床放入电泳槽中，加样孔靠近阴极的一端。