上海交通大学微生物实验课件实验六细菌的药敏试验详解.pptVIP

* * * * 实验六 细菌的药敏实验 （含水中大肠菌群的测定结果） 本次实验内容 生化实验结果判定 平皿培养基的倾注 药敏实验 EMB培养基接种 目的要求 学会平皿培养基的制备 掌握滤纸法测定细菌对各种药物的敏感性 p93 理解药物敏感试验的使用原则 掌握水中总大肠菌群的测定 一、平皿培养基制备 取出已高压灭菌的培养基，每8个人为一组，擦干三角烧瓶外面的水珠 在微波炉上加热至沸腾，但不能溢出，注意安全 慢慢冷却至手可以握住，但还有一点烫手感觉 严格的无菌操作，三角烧瓶的口一定要灼烧，在酒精灯旁倾注平皿，每个平皿6ml左右，不能太厚，不能太薄 冷却平皿，待琼脂凝固后，将平皿倒置，以备用 二、药敏实验的原理 一种微生物在代谢过程中产生的分泌到细胞外、对多种微生物产生抑制作用的物质为抗生素(Antibiotic) 。是由某些生物合成或半合成的一类次级代谢产物或衍生物，它们在很低浓度时就能抑制或影响它种生物的生命活动，如抑制其生长。 各种微生物对每种抗生素的敏感性是不同的，凡能被抗生素抑制微生物在滤纸圈外出现不同程度的抑菌圈，根据抑菌圈的大小可以判定细菌对药物的敏感度。 临床中，由于大量耐药菌株的产生，很多抗生素不再发挥作用，因此为了筛选有效药物，控制微生物的生长，必须进行药敏实验,根据药敏实验可以筛选敏感药物，用于临床上细菌性疾病治疗。 抑制细菌细胞壁合成、 破坏细胞质膜、 作用于呼吸链以干扰氧化磷酸化、 抑制蛋白质和核酸合成等 抑制微生物的生长 注意点：（1）标准革兰氏阳性菌和阴性菌 （2）敏感、中度敏感、抗性的判断 （3）此为定性试验 MIC:最低抑制浓度 MIC50 MIC90 药敏实验操作方法 （1）挑取普通营养琼脂平板上的纯培养菌落，接种于普通营养肉汤，37℃培养16～18小时（药敏实验的细菌种子一定要处于对数生长期） （2）用移液器吸取0.1ml, 加到平皿中，用L棒将菌液涂布均匀。 （3）待平板上的水分被琼脂完全吸收后再贴药敏纸片。用无菌镊子取药敏纸片贴在平板表面，纸片一贴就不可再拿起。每个平板贴3张纸片，呈梅花型。 （4）至少过5分钟后，将平板反转，标记姓名、药敏纸片， 37℃、18～24小时后取出，并测量抑菌圈直径。 利用L棒进行涂布 药敏试验的注意事项 细菌必须是涂布，而不是分区划线 每个药敏纸片不能相互靠近，呈梅花型放置 用游标卡尺测量抑菌圈直径，从平板背面测量最接近的整数毫米数并记录 药物的有效性以试纸周围的抑菌圈（透明圈）的直径的大小来确定，有的菌株可出现蔓延生长，进入抑菌环，磺胺药在抑菌环内出现轻微生长，这些都不作为抑菌环的边缘。 依据不同药物的抑菌标准，判断敏感、中度敏感、抗性。 美国临床实验室标准研究所（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI) 三、EMB接种 伊红美兰培养基（EMB） 乳糖，伊红和美兰（抑制阳性菌），弱选择性，发酵乳糖产生的酸使两种染料结合成复合物，产生带金属光泽的菌落 选择乳糖胆盐发酵管阳性（产酸产气）的试管，进行EMB培养基的接种 从试管中挑取一环培养物，在EMB培养基上进行分区划线 37℃培养16～18小时，观察并记录菌落特征 实验报告 实验目的 实验原理 实验步骤 实验结果 实验体会 思考题 p97 (8、9、11) 在测定水中总大肠菌群时，为什么选择乳糖胆盐发酵管阳性的再接种EMB培养基？ 下次实验 污水中噬菌体的分离 P35 鉴别性培养基是在培养基中加入能与某菌的无色代谢产物发生显色反应的指示剂，从而用肉眼就能将其与其他外形相似的菌落区分。EMB培养基中大肠杆菌，因其强烈分解乳糖而产生大量的混合酸，菌体带H+,故可染上酸性染料伊红，又因伊红与美蓝结合，使菌落呈深紫色。从菌落表面反光还可看到绿色金属闪光。而产酸弱的菌株的菌落呈棕色。不发酵乳酸的菌落无色透明。 大肠菌群并非细菌学分类命名，而是卫生细菌领域的用语，它不代表某一个或某一属细菌，而指的是具有某些特性的一组与粪便污染有关的细菌，这些细菌在生化及血清学方面并非完全一致，其定义为：需氧及兼性厌氧、在37℃能分解乳糖产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。一般认为该菌群细菌可包括大肠埃希氏菌、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * *