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下一代测序技术 摘要|从未有过的巨大革命技术需求交付快速、廉价、准确的基因组信息。这一挑战也促进了下一代测序技术的发展。传统方法主要的优势是生产大量廉价的序列数据。在这里,我进行一下技术回顾，模板制备、测序成像、基因定位和装配方法以及当前的最新进展和短期商用的下一代测序技术。除了为解决生物问题的兴趣提供平台选择指导,再略述下一代测序技术的广泛应用。 在过去的四年里，进行基因组分析的自动化桑格测序技术的应用发生了根本性的转变。在这之前，自动化桑格技术主导该产业几乎20年，并作出了巨大的成就，包括唯一完整的人类基因组序列。尽管在这个年代很多技术都在提高，然而自动化桑格测序技术的局限性，展现出对一种面向大量人类基因组测序的新的改良技术的需求。最近致力于研究新的方法，桑格测序可能提的会少一些。因此，本篇文章不包括桑格测序，有兴趣的读者可以读一下前面的文章。 自动化桑格方法被认为是“第一代”技术，新的方法被称为下一代基因测序。这些新技术组成不同的策略，依赖于模板准备，测序和成像，基因组比对和装配的方法结合。下一代测序技术的到来改变了我们在基础、应用和临床研究方面的思考方式。在某些方面，下一代测序技术类似于以前的聚合酶反应链，主要使用局限在成像方面。下一代测序技术的提高在于其能廉价地生产出一个巨大的数据量，在某些情况下仪器运行超过十亿短读。这个特性扩展了实验以外的领域，不仅仅是在确定的顺序集上。例如，基因表达研究基因芯片现在被基于序列的方法所代替，这种方法可以识别和量化罕见的转录体，没有先验知识的一个特定的基因，并且提供特定基因的可变剪接和序列变化方面的相关信息。测序许多相关生物的整个基因组的能力使得大规模的比对和进化研究被实施，这在几年前是不可想象的。下一代测序技术最广泛的应用可能是对人类基因的重新排序以增强人们对不同的基因如何影响健康和疾病的理解。下一代测序的各种特性使得它在市场上可能共存于多个平台，因为它在特定应用上有明显的优势。 本文专注于商用技术，来自罗氏/ 454,Illumina/ Solexa,LIFE/ APG和Polonator Helicos生物科学仪器和近期的太平洋生物科学，旨在2010年将他们的测序设备引进市场。纳米孔测序没有被覆盖，尽管有兴趣的读者通过布兰顿和他的同事们针对一篇文章，描述了进展并对这项技术保持挑战。在这里，我提出一个技术的回顾，模板准备，测序和成像，基因组比对和装配，当前下一代基因测序平台的性能，为这些技术如何工作和如何将这些技术应用于重要的生物问题上提供指导。我强调用目标和整个基因组方法进行人类基因组重组的应用，讨论这些方法的进展和局限性，和接下来几年即将看到的进展和预期的影响。 下一代测序技术 测序技术包括很多方法，宽泛的分为模板准备，测序和成像，数据分析。特定协议的独特结合使得一个技术区别于其他技术，决定着来自每个平台产生的数据类型。当基于数据的质量和成本比较时这些输出数据的不同面临挑战。尽管质量分数和精度估计是由每个制造商提供的，从一个平台到另一个平台“质量基础”是没有一致性的。下文将会讨论各种测序指标。 在下面几节中，讨论模板准备和测序成像，因为它们适用于现有和近期的商业平台。下面有两种方法用于为下一代测序反应准备模板：从单个DNA分子克隆扩增的模板，和单个DNA分子模板。合成测序，在文献中用于描述大量的脱氧核糖核苷酸的方法，在这篇文章中，因为它无法描述测序中的不同机制，所以没有用到。相反，这些方法被列为循环可逆终止（CRT），单基因（SNA）和实时测序。还描述了结扎测序（SBL），一种由DNA连接酶替换DNA聚合酶的方法。成像方法再加上这些从测量生物发光信号到单核分子的四色成像事件测序策略。下一代测序平台产出大量数据代替了信息技术在数据存储，追踪和质量控制方面的大量需求。 模板准备 需要一个健壮的方法产出一个代表，基因组在调查过程中再怎么强调核酸物质的无偏来源都不为过。目前的方法通常致力于随机的将DNA基因组破坏为较小规格的DNA从中创建片段模板或是双端模板。在下一代测序技术中的一个普遍主题是模板固定或支撑在固体表面。空间的固定分离了模板珠允许数十亿的测序反应同时进行。 克隆扩增模板大多数成像系统没有被设计为检测单一的荧光事件，所以需要扩增模板。两种最普通的方法是感光乳剂聚合酶链反应和固相扩增。感光乳剂聚合酶链反应被用于在非细胞系统准备测序模板，有利于避免基因组序列的任意损失。在细菌克隆方法中存在一个固有的问题。一个片段或配对库被创建后，转接器包含通用的启动点，被绑定在目标末端。允许复杂的基因组用普通的聚合酶链反应引物进行扩增。绑定之后，DNA被分离成单股并捕获到每个支持一个DNA分子的点的情况。在成功扩增和改进感光乳剂聚合酶链反应后，数百万可以固定聚丙烯酰胺凝胶在一个标准的显微