胰酶联合Ⅱ型胶原酶分离培养髓核细胞：培养基中葡萄糖浓度的选择资料.doc

胰酶联合Ⅱ型胶原酶分离培养髓核细胞：培养基中葡萄糖浓度的选择 张存鑫，马进峰，王德春 青岛大学附属医院脊柱外科，山东省青岛市 266000 引用本文：张存鑫，马进峰，王德春. 胰酶联合Ⅱ型胶原酶分离培养髓核细胞：培养基中葡萄糖浓度的选择[J].中国组织工程研究，2016，20 20 :2899-2906. DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.20.002 ORCID: 0000-0003-1296-2883 王德春 文章快速阅读： 文题释义： 胶原酶：是从溶组织梭状细胞芽孢杆菌提取制备的，主要水解结缔组织中胶原蛋白成分。当拟消化的组织较硬，内含较多结缔组织或胶原成分时，用胰蛋白酶解离细胞的效果较差，这时可采用胶原酶解离细胞法。胶原酶分为Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ型以及肝细胞专用胶原酶，要根据所要分离消化的组织类型选择胶原酶类型。 髓核：是乳白色半透明胶状体，富于弹性，为椎间盘结构的一部分，位于两软骨板与纤维环之间。由纵横交错的纤维网状结构即软骨细胞和蛋白多糖黏液样基质构成的弹性胶冻物质。 摘要 背景：椎间盘退变是脊柱退行性疾病的发病基础，研究椎间盘的退变因素，对脊柱退行性的疾病的预防和治疗有重要意义。 目的：采用胰酶联合Ⅱ型胶原酶消化法体外分离培养兔髓核细胞，并观察髓核细胞在不同葡萄糖浓度培养基中的生长及增殖状况，确立最适宜髓核细胞生长的葡萄糖浓度。 方法：胰酶联合Ⅱ型胶原酶消化法分离、培养兔髓核细胞，倒置显微镜观察细胞形态并计数细胞数量，绘制细胞生长曲线。苏木精-伊红和甲苯胺蓝染色观察细胞形态。细胞免疫组织化学染色结合免疫荧光染色检测Ⅱ型胶原蛋白表达情况。分别使用0，6.25，12.5，17.5，25 mmol/L葡萄糖培养基培养髓核细胞24 h后，检测各组髓核细胞增殖及凋亡情况。 结果与结论：①髓核细胞形态：兔髓核细胞染色后镜下观察呈多角形、短梭形，有一两个核仁，随着传代次数增加，细胞伸出伪足，胞体逐渐变细长；②基因表达：体外分离培养髓核细胞的Ⅱ型胶原蛋白及聚集蛋白多糖基因均可稳定表达；③细胞增殖：各组中细胞增殖比率以葡萄糖17.5 mmol/L组最高，显著高于葡萄糖0，25 mmol/L组 P 0.05或P 0.01 ；④细胞凋亡：葡萄糖0 mmol/L组细胞凋亡率最高 P 0.05 ，其他各组差异无显著性意义 P 0.05 。④结果证实：胰酶联合Ⅱ型胶原酶消化法可收获较多的原代髓核细胞，葡萄糖浓度17.5 mmol/L比较适宜髓核细胞体外培养。 关键词： 组织构建；软骨细胞；髓核细胞；培养基；椎间盘；葡萄糖；细胞培养技术；细胞增殖；Ⅱ型胶原；聚集蛋白多糖；Ⅱ型胶原酶消化法；国家自然科学基金 主题词： 组织工程；椎间盘；细胞凋亡；葡萄糖 基金资助： 国家自然科学基金 座机电话号码 Trypsin plus type II collagenase digestion for isolation of nucleus pulposus cells: the optimal glucose concentration in complete medium Zhang Cun-xin, Ma Jin-feng, Wang De-chun Department of Spine Surgery, the Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266000, Shandong Province, China Abstract BACKGROUND: Intervertebral disc degeneration is the pathological basis of degenerative spinal diseases. Studies on the influential factors of intervertebral disc degeneration contribute to the prevention and treatment of degenerative spinal disease. OBJECTIVE: To observe the growth and proliferation of nucleus pulposus cells isolated by trypsin plus type II collagenase digestion in complete medium with different glucose concentrations, exploring the optimal glucose concentration for growth of nucl