细胞培养实验指导4.docVIP

细胞培养实验指导 陈轶霞 刘俊林 实验报告书写要求： 1、学生实验后应按时完成并提交实验报告。报告要求结构完整、内容充实、图表齐全、书面整洁、分析讨论认真合理等。 2、严禁互相抄袭实验报告，发现雷同实验报告一律视为不及格。 3、切忌全班同学统一打印相同的实验结果图（以前曾发生过全班同学共用一张错误的图的情况） 实验一 细胞培养实验室介绍及使用卫生要求 【目的与要求】 1.了解细胞培养实验室的基本设施和布局 2. 掌握细胞培养实验室的使用卫生要求 【基本原理】 细胞培养必须无菌操作，要求工作环境和条件必须保证无微生物污染和不受其它有害因素影响，应建立专门的实验室并划分不同功能区。理想的细胞培养实验室可分为准备室、更衣室、缓冲室、培养室等。 【内容与方法】 1．通过教师讲解并参观了解开展本课程教学的细胞培养实验室的布局、设施与仪器设备的摆放情况 2.使用卫生要求。 （1）实验室的消毒 实验室日常用紫外灯消毒对实验室洁净区熏蒸消毒发生严重污染熏蒸消毒C02培养箱、电热干燥箱、冰箱、倒置显微镜、超净工作台、过滤除菌装置、纯化水装置、细胞冷冻贮存器、离心机、天平、移液器、血球计数板、高压蒸汽消毒装置等。 常用器材： 玻璃器皿： 培养瓶、培养皿、离心管、注射器、储液瓶、吸管、载玻片、盖玻片、漏斗、烧杯、量筒等。 塑料品： 冷冻管、多孔培养板、离心管等。 器械： 解剖刀、眼科剪和镊、中号圆头镊、止血钳等。 橡胶制品：各种规格胶塞。 杂用品： 金属饭盒、试管架、记号笔、搪瓷盘、吸头、酒精灯、酒精、碘酒棉球瓶和火柴等。吸管筒等。 注：（不写实验报告） 准备实验要求：整理常用器械并置于瓷盘内，以便演示讲解。 实验三　　实验器材的清洗、包装和灭菌 【目的与要求】 掌握细胞培养常用实验器材的清洗、包装、灭菌方法以及注意事项。 【实验原理】 离体条件下细胞对任何有害物质十分敏感，极少残留物都可以对细胞产生毒副作用。因此，10min→刷洗→流水振荡冲洗→沥水→清洁液浸泡24小时→流水振荡冲洗15～20遍→沥水→蒸馏水冲洗3次→50℃烤干， 3．包装 清洗后的培养瓶、培养皿、注射器、金属器械等器材用牛皮纸进行严密包装，， 湿热灭菌：将包装好的物品放入压力蒸汽灭菌器内，15磅，20min。 干热消毒：主要用于玻璃器皿消毒， 190～120min。 注：（不写实验报告） 准备实验要求： 1、将清洗场所摆置整齐，比如清洗用洗盆、凳子、毛刷摆放整齐； 2、放置3桶纯净水，并做好顺序标记以方便学生完成冲洗流程； 3、配置好清洁液，并事先放入适量玻璃器皿以备教学之用； 4、安排好烘干烤箱，并分别张贴好：“自来水冲洗烘干烤箱”和“纯净水冲洗烘干烤箱”； 5、准备好包装所用的用品及器械，供教学时演示。 实验四 细胞培养用液的配制 【目的与要求】 1. 掌握完全培养液、Hank’s液 细胞培养离不开细胞在体外生存和生长的各种溶液，即培养用液。培养用液主要包括培养液、平衡盐溶液、血清以及消化液、pH调整液和抗生素液等。配置容器要严格清洗、消毒。要明确标注所配液体名称及配制日期。制备好的培养用液要及时消毒除菌并分装, 在适当的条件下贮存。 【器材与试剂】 过滤器、试剂瓶、烧杯、容量瓶、吸管、移液器、KCl、KH2PO4、NaCl、NaHCO3、Na2HPO4.7H2O、酚红、DMEM、血清、双抗、5.6%的NaHC03 溶液、三蒸水等 【内容与方法】 1. 各组配制500mL D-Hanks液 （1）用数滴5.6%的NaHC03 溶液溶解0.01g酚红； （2）称取0.2g KCl、0.03g KH2PO4、4g NaCl、0.175g NaHCO3、0.03gNa2HPO4.7H2O依次溶解于适量三蒸水中( 注意应待前一种试剂完全溶解后，再溶解下一种成分)。 （3） 将（1）加入（2）中； （4） 将（3）移入容量瓶中，定容至500mL； （5）分装，10磅20分钟高压蒸气灭菌，4℃冰箱内保存。 2. 各组练习配制30mL完全培养液，培养无菌操作意识。 在超净台内按照无菌操作要求取27mL DMEM液，加入3 mL血清、300μL双抗，练习过滤除菌方法。 注：（不写实验报告） 准备实验要求：在超净台内放置好做好标记的DMEM液、血清、双抗（3种都可用替代品）、用过的过滤器（平时注意收集）、吸管、洗耳球、烧杯及培养瓶等。 实验五　　培养细胞的观察 【目的与要求】 掌握倒置显微镜观察贴壁型细胞的方法。 【实验原理】 细胞在体