羊抗人白蛋白抗体效价的测定资料.docVIP

羊抗人白蛋白抗体效价的测定 摘要 目的:通过酶免疫吸附实验间接法对羊抗人白蛋白抗体的效价的测定，以判断是否可以通过本方法对待测抗体效价测定。方法：酶免疫吸附实验间接法，先通过预实验探讨出最适合的包被抗原人白蛋白的和最适合的兔抗羊血清的最适合浓度，将白蛋白抗原以1:1、1:4、1：8、1：16倍比稀释，兔抗人血清以1:1000、1：4000、1:8000、1:16000倍比稀释，待测抗体以1:16、1:64、1:256、1:1024、1：4096倍比稀释寻找最好的OD值梯度的包被抗原和兔抗羊血清的浓度组，以此浓度组来进行待测抗体效价的测定。结果：待测抗体通过1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024、1:2048、1:4096、1:8192、1:16384倍比稀释后OD值显示出明显的梯度但由于阴性对照或稀释比不够的情况未能检测出待测抗体的效价。结论：酶免疫吸附间接法能对待测抗体效价的测定。 关键词 ELISA间接法；羊抗人白蛋白；效价测定 前言 ELISA法具有较高灵敏度、特异性强、重复性好、可进行定量和半定量测定等优点，可以在酶免疫分析仪上做批量检测。而ELISA间接法常用于检测人类免疫缺陷病毒（HIV）、丙型肝炎病毒抗体及梅毒螺旋体抗体等IgG类抗体。机体在外界长期接触时会受环境刺激产生大量的非特异性IgG类抗体，这些高浓度的非特异性IgG抗体有可能对固相产生吸附从而产生假阳性反应，所以在应用此方法进行测定时常需先将样本做一定的稀释来避免非特异性IgG抗体对检测的干扰[1]。 1.材料与方法 1.1试剂：PBS、包被液、封闭液、终止液、洗液、人白蛋白、羊抗人白蛋白抗体、兔抗羊血清、显色剂A、显色剂B、阴性对照液。 1.2仪器：酶标仪 编号：座机电话号码 单位：检验医学实验教学中心 型号：Model 680 、微孔洗板机（编号：座机电话号码 单位：检验医学实验教学中心 型号：MODEL 1573 、电热恒温培养箱、移液器、一次性试管、移液器枪头 。 1.3方法： 1.3.1.溶液配置：10*PBS 磷酸二氢钾:2g；氯化钾：2g；十二水和磷酸氢二钠：35.8g；氯化钠：80g；1000ml蒸馏水 、洗液（PBS1000ml+500ul吐温20）、包被液（碳酸钠：1.6g；碳酸氢钠：2.9g；1000ml蒸馏水）、封闭液（洗液100ml+1g干酪素）终止液（6ml浓硫酸+100ml蒸馏水）、阴性对照液（人血清2ml+PBS2ml）。 1.3.2.预实验得到最适合的包被抗原人白蛋白的和最适合的兔抗羊血清的最适合浓度：以包被抗原人白蛋白倍比稀释包板（过夜），洗涤后加封闭液（热封闭2h），洗涤后加倍比稀释的待测抗体和阴性对照温育30分钟，洗涤后加倍比稀释的兔抗羊血清温育30分钟，洗涤后加显色剂A加显色剂B温育15分钟，加终止液震荡后在酶标液上测定OD值。寻找出最好的OD值梯度的包被抗原和兔抗羊血清的浓度组。如图1所示： 图1 一抗浓度 二抗稀释梯度 1:16 1:64 1:256 1:1024 1:4096 阴性 1:16 1:64 1:256 1:1024 1:4096 阴性 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1：1000 A 1：4000 B 包被浓度为16ug/ml 包被浓度为4ug/ml 1：8000 C 1：16000 D 1：1000 E 1：4000 F 包被浓度为2ug/ml 包被浓度1ug/ml 1：8000 G 1：16000 H 1.3.3.以选好的最好的OD值梯度的包被抗原和兔抗羊血清的浓度组来对待测抗体效价的测定：以选好的最好包被抗原人白蛋白的稀释浓度2ug/ml包板（过夜），洗涤后加封闭液（热封闭2h），洗涤后加倍比稀释的待测抗体1:2、1:4、1:8、1:16、1:32、1:64、1:128、1:256、1:512、1:1024、1:2048、1:4096、1:8192、1:16384和阴性对照液温育30分钟，洗涤后加最好的倍比稀释的兔抗羊血清浓度1:8000温育30分钟，洗涤后加显色剂A加显色剂B温育15分钟，加终止液震荡后在酶标液上测定OD值。如图2所示 图2： 二抗稀释梯度 ` 一抗稀释梯度 1:8000 A B C D E F G H 1 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 2 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 3 1:512 1:1024 1:2048 1:4096 1:8192 1:16384 阴性对照 阴性对照 4 1:512 1:1024 1:2048 1:4096 1: