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生物蛋白纯化 1引言［ 1］ 亲和层析的原理是：生物分子间存在很多特异性的相互作用，它们之间都能够专一而可逆的结合，这种结合力就称为亲和力。亲和层析就是通过将具有亲和力的两个分子中一个个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。被固定在基质上的分子称为配体，配体和基质是共价结合的，构成亲和层析的固定相，称为亲和吸附剂。亲和层析时首先选择与待分离的生物大分子有亲和力的物质作为配体，并将配体共价结合在适当的不溶性基质上。将制备的亲和层析剂装柱平衡，当样品溶液通过亲和层析柱的时侯。待分离的生物分子就与配体发生特异性结合，从而留在固定相上；而其它杂质不能与配体结合，仍在流动相中，并随洗脱液流出，这样层析柱中就只有待分离的生物分子。通过适当的洗脱液将其从配体上洗脱下来，就得到了纯化的待分离物质。 亲和层析的优点是它分离蛋白经常只需要经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂生物蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。此外蛋白在纯化过程中得到浓缩，结合到亲和配基后，性质更加稳定，其结果提高了活性回收率。它可以减少纯化步骤，缩短纯化时间，对不稳定的蛋白纯化十分有利。 2材料 2.1 材料和试剂 2.1.1菌株与质粒 大肠杆菌BL21(DE3), Genscript保藏；表达载体pCold TF，Genscript保藏；pCold TF- Cement protein，Genscript构建 。 2.1.2主要试剂 Ni-IDA亲和层析凝胶：Genscript生产； LB液体培养基(g/L)：胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L，酵母提取物(Yeast extract) 5g/L，氯化钠(NaCl) 5g/L ,用NaOH调节该培养基的pH为7.4； 氨卡青霉素溶液：50μg/mL； IPTG：0.5mmol/L； Tris-HCl：50mM,PH8.0； 蛋白Marker:TIANGEN公司,MP102；［ 2］ Lysis Buffer : 50mM Tris-HCl 200mM ；NaCl ；pH8.0； Wash Buffer 1 : 50mM Tris-HCl 200mM ；NaCl ；20 mM 咪唑 ；pH8.0； Wash Buffer 2 : 50mM Tris-HCl 200mM ；NaCl ；50 mM 咪唑 ；pH8.0； Elution Buffer : 50mM Tris-HCl 200mM ；NaCl ；250mM 咪唑 ；pH8.0； 洗涤缓冲液 : 150mM PBS,0.5mLTween-20(0.13%),PH7.4； 封闭液 : 脱脂奶粉(5%),PBS； 蛋白电泳试剂：丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、蛋白质分子量标准为上海生工公司产品； 丙烯酰胺储备液:30%（w/v）丙烯酰胺，0.8%（w/v）甲叉双丙烯酰胺；丙烯酰胺 29.2 g，甲叉双丙烯酰胺0.8 g，加蒸馏水至100 mL，用滤纸过滤后于棕色瓶中4℃存放； 分离胶缓冲液（1.5 M/L，pH8.8）：18.15g Tris（分析纯），用1M/L HCl调节pH至8.8，加水至100 mL，4℃存放； 浓缩胶缓冲液（0.5 M/L，pH6.8）：6g Tris，用1M/L HCl调节pH至6.8，加水至100mL，4℃存放； Tris-甘氨酸电泳缓冲液：6g Tris，28.8g甘氨酸，2g SDS，加水至2L； SDS溶液(10%)：10g SDS，加水定容至100mL，完全溶解后室温存放； 过硫酸铵溶液(10%)：0.1 g过硫酸铵（分析纯），加1 mL蒸馏水溶解； 5×样品缓冲液：0.6mL Tris-HCl缓冲液（1mol/L，pH 6.8）、5 mL 50%（v/v）甘油、2 mL 10% SDS、0.5 mLβ－巯基乙醇、1 mL 1%（w/v）溴酚蓝、0.9 mL蒸馏水。4℃存放； 12%分离胶的配制： 蒸馏水3.5 mL，30%丙烯酰胺储备液(A液)4 mL，分离胶缓冲液(B液)2.5 mL，10%过硫酸铵50μl，TEMED 5 μl； 5%浓缩胶的配制： 蒸馏水2.3 mL，30%丙烯酰胺储备液(A液)0.67 mL，浓缩胶缓冲液(C液)1.0 mL，10%过硫酸铵30μl，TEMED 5μl； 考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝R-250 1 g，甲醇450 mL，冰醋酸100 mL，蒸馏水450 mL； 脱色液：甲醇200 mL，冰醋酸200 mL，蒸馏水1600 mL。 封闭液：5%脱脂牛奶或者20%BSA 2.1.3主要仪器 PK-8D型电热恒温水槽 (上海精宏实验设备有限公司) TH2-25大容量恒温震荡器