药典-蛋白质含量测定(紫外吸收法Lowrry法双缩脲法).docVIP

3.1.1 蛋白质含量 第一法 紫外吸收法（见EPO） 用4g/L的碳酸氢铵溶液将供试品稀释至0.5~2mg/ml，作为供试品溶液。以4g/L的碳酸氢铵溶液作为可被，测定供试品溶液在320nm、325nm、330nm、335nm、340nm、345nm和350nm的吸光度。用读出的吸光度的对数与其对应波长的对数作直线回归，求得回归方程。紫外-可见分光光度法，在波长276~280nm处，测定供试品的溶液最大吸光度Amax，将Amax对应波长代入回归方程，求得供试品溶液由于光散射产生的吸光度A光散色。计算供试品蛋白质含量，应不低于0.5mg/ml。 蛋白质含量 mg/ml Amax -A光散色 / 7.43 x 供试品稀释倍数 x 10。 1.仪器的校正和鉴定 1 波长 允许误差：紫外光区±1nm，500nm附近±2nm 2 吸光度的准确度 可用重铬酸钾的硫酸溶液检定。 3 杂散光 碘化钠、亚硝酸钠 2.测定法， 1 对照品比较法 cx Ax/AR cR，其中cx 为供试品浓度；Ax 为供试品溶液的吸光度cR 为对照品浓度；AR为对照品溶液的吸光度。 2 吸收系数法 通常吸收系数大于100 3 计算分光光度法 4 比色法 第二法 Lowry法 本法用于微量蛋白质的含量測定。蛋白质在碱性溶液中可形成铜-蛋白质复合物，此复合物加入酚试剂后，产生蓝色化合物，该蓝色化合物在波长650nm处的吸光度与蛋白质含量成正比，根据供试品的吸光度，计算供试品的蛋白质含量。 试剂 1〉酚试剂 称取钨酸钠（Na2WO4·2H2O）100g、钼酸钠（Na2MnO4·2H2O）25g，置1500ml蒸馏瓶中，加入700ml水、85%磷酸50ml、盐酸100ml，上连回流管（使用木塞或锡纸包裹的橡皮塞）微沸回流10小时。取下回流管，加入硫酸锂150g 、水50ml、溴液几滴，煮沸约15分钟，驱除过量的溴，冷却，加水至1000ml，过滤，为酚试剂贮备液。 酚试剂贮备液用氢氧化钠滴定液（0.5mol/L）測定酸浓度，然后加水稀释至相当于1mol/L盐酸浓度。 2）碱性铜溶液 量取0.1mol/L酒石酸钾溶液与0.04mol/L.硫酸铜溶液各0.5m1，%4碳酸钠溶液与0.8%氢氧化钠溶液各25ml，摇匀，即得。本液应临用配置。 3）氢氧化钠滴定液（0.5mol/L 的配制及标定 取氢氧化钠适量，加水搅拌使溶解成饱和溶液，冷却后，置聚乙烯塑料瓶中，静置数日，澄淸后，量取澄淸的氢氧化钠饱和溶液28ml，加新煮沸后冷却的水，使成1000ml，摇匀。 取在105℃干燥至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾约3g，精密称定，加新沸过的冷水50m1，振摇，使其尽量溶解；加酚酞指示剂2滴，用本液滴定；在接近终点时，应使邻苯二甲酸氢钾完全溶解，滴定至溶液显粉红色，每1ml氢氧化钠滴定液相当于102.1mg的邻苯二甲酸氯钾。根据本液的消耗量与邻苯二甲酸氢钾的取用量，算出本液的浓度。 标准蛋白质溶液的制备 用水将蛋白质标准品定量稀释至每1ml含1mg，作为贮备液。精密量取贮备液2.5m1置25ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即为100μg/ml的标准蛋白质溶液。 測定法 精密量取一定体积供试品（含蛋白质50μg左右）置试管内，加水至1ml，加碱性铜溶液5ml，摇匀，室温放置10分钟，快速加入酚试剂0.5m1，摇匀，室温放置30分钟，显色后，照紫外-可见分光光度法 附录IIA），在波长650nm处测定吸光度（呈色后，如发现浑浊，经每分钟3000转离心15分钟后，取上清液測定〉。精密量取标准蛋白质溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0m1分別置于试管中，自加水至1ml起，同法操作。准确量取水1ml，自“加碱性铜溶液5m1”起，同法操作，作空白对照。以标准品的蛋白质浓度对其相应吸光度作直线回归，求得直线回归方程；将測得供试品的吸光度代入直线回归方程，即得供试品的蛋白质含量。 第三法 双缩脲法 本法系依据蛋白质肽键在碱性溶液中与Cu2+形成紫红色络合物，其颜色深浅与蛋白质含量成正比，利用标准蛋白质溶液作对照，采用紫外可见分光光度法測定供试品蛋白质含量。 试剂 双缩脲试剂 取硫酸铜（CuSO4·5H2O）3.0g、酒石酸钾钠（KNaC4H4O6·4H2O 9.0g、碘化钾5.0g、氢氧化钠24g，加水溶解并稀释至1000m1，摇匀，即得。 标准蛋白质溶液的制备 用水将蛋白质标准品定量稀释成50mg /m1的溶液。 供试品溶液的制备 精密量取适量的供试品，加水制成50mg /m1的溶液。 测定法 分别精密量取供试品溶液与标准蛋白质溶液各0.05m1置玻璃试管中，分别加双缩脲试剂4.0m1，混匀，置