蛋白酶酶活测定方法及原理简介.docVIP

蛋白酶酶活测定方法及原理 Protease activity assay method and principle 方法 原理 福林酚法 福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色钼蓝和钨蓝混合物，而蛋白质分子中有含酚基的氨基酸如酪氨酸、色氨酸等，可使蛋白质及其水解产物呈上述反应，利用此原理测定蛋白酶酶活。 考马斯亮蓝法 考马斯亮蓝染料与蛋白质在酸性条件下结合，主要是染料与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合，使染料的最大吸收峰的位置由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色，在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。 甲醛滴定法 蛋白酶催化蛋白质水解成氨基酸，再用甲醛固定氨基酸的氨基，用0.1mol/LNaOH溶液滴定生成的氨基酸，从而测定其酶活。 DHT-酪蛋白法 用5-氨基四唑重氮盐将氨基酸中部分组氨酸和酪氨酸重氮化，得到黄色的重氮5-氨基四唑酪蛋白（DHT-酪蛋白）。以DHT-酪蛋白为底物，在蛋白酶作用下，水解生成DHT-肽，二价离子可与DHT-蛋白与DHT-肽形成稳定的可溶性红色螯合物，而锌离子可迅速沉淀DHT-酪蛋白，但不沉淀DHT-肽。选用合适浓度的锌离子和镍离子作为沉淀剂和显色剂，利用比色法可测定蛋白酶酶活。 DNA-溴乙锭荧光 分析法 溴乙锭插入双链DNA的碱基对之间时，可使DNA的荧光增加25倍。接近饱和的溴乙锭 0.5μg/mL 与DNA 混合时，其荧光增加量与DNA的浓度呈正比。在DNA-组蛋白-溴乙锭溶液中加入蛋白酶时，蛋白酶水解结合在DNA链上的组蛋白，使DNA 结合部位暴露出来，溴乙锭重新插入DNA双链中，荧光增加量与蛋白酶活性呈正比。通过测定DNA溶液的荧光增量来计算蛋白酶的活性。 X-光胶片法 酶的底物明胶涂抹在X-光胶片上，当待测酶液滴加到X-光胶片上时，酶将X-光胶片上的明胶水解，用水冲洗胶片，即可看到胶片上明胶被酶水解的地方，出现透明的圆圈。酶活性的高低与透明圆圈的面积成正比。测定圆圈的面积以测定蛋白酶的活性。