环境水中细菌种类分布及耐药性研究2.docVIP

环境水中细菌种类分布及耐药性研究 摘要：目的 了解环境水中细菌的种类、分布及其耐药性。 方法 无菌采集环境水，增菌后分离、鉴定细菌，K—B法和MIC法测定分离菌对药物的敏感性，PCR法检测耐药基因。 结果 从***市环境水中分离出150株细菌，其中弧菌78株，肠杆菌33株，非发酵菌28株，微球菌5株，葡萄球菌5株，链球菌1株；分离自医院周边50株、养殖场周边27株，生活区周边73株。弧菌对头孢唑林耐药率较高为46.15%，肠杆菌对四环素、头孢唑林耐药率为24.24%，非发酵菌对氨曲南耐药率较高为35.71%。生活区周边分离菌对头孢唑林耐药率最高(33.78%)，其次为庆大霉素(14.86%)；医院周边分离菌对头孢唑林耐药率最高(26.0%)，其次为氯霉素(18.0%)；养殖场周边分离菌对四环素耐药率最高(29.62%)，其次为头孢唑林(22.2%)。生活区周边分离弧菌耐药率最高(61.36%)，医院和养殖场周边分离的肠杆菌耐药率最高(66.67%)；医院周边分离的非发酵菌多重耐药率最高(60.00%)。检出4株产ESBLs菌株，携带TEM、SHV、CTX—M9耐药基因，未检出CTX—M1、CTX—M2、CTX—M8及VEB基因；非发酵菌中有10株对碳青霉烯酶耐药，1株携带OXA—24基因，2株携带OXA—51基因，2株携带SHV基因，未检测到TEM、OXA—23、OXA—58基因；27.8%(5/18)庆大霉素耐药菌株携带有ant(3’’)—I基因，44.4%(8/18)携带aac(3)—I基因，未检测到aac(3)—II基因、aac(6’)—I基因。结论 ***市环境水中细菌种类多，存在多种耐药基因。 关键词：环境水；耐药性；细菌种类及分布；超广谱β内酰胺酶 环境水体中细菌种类繁多，与人类生活密切相关，不仅水中的微生物可来源于人类的各种活动，人也可因多种活动而接触水中的微生物甚至感染，如经口进入人体，引起腹泻、食物中毒等肠道感染性疾病，经破损皮肤黏膜侵入引起伤口感染等[1]。另外沙门菌、志贺菌及霍乱弧菌都可经由水传播，引起传染病的暴发流行。自1942年首次报道对青霉素耐药的金黄色葡萄球菌以来，人们开始认识到并逐步重视细菌的耐药性。耐药菌的出现增加了感染性疾病治愈的难度，其治疗成为世界性关注的问题，对其耐药情况分析具有重要意义。耐药菌和其他细菌一起通过多种途径进入环境水中，使水环境成为一个巨大的储菌库和耐药基因库。水环境中的耐药菌和耐药基因又可通过多种途径传播，人或动物可因接触环境水而形成携带甚至被感染，给人类的健康和生态平衡带来危害。 本研究旨在了解**市环境水中细菌的构成及细菌耐药性和耐药基因分布情况，结果报告如下： 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1样品 2015年7月—9月，无菌采集医院周边、居民生活区、养殖场周边环境水。 1.1.2主要试剂 营养琼脂、水解酪蛋白琼脂(北京奥博星)；无菌脱纤维绵羊血(温州求精)；细菌微量生化反应管(杭州滨河)；环丙沙星、头孢吡肟、庆大霉素、四环素、氯霉素、头孢唑林、头孢噻肟、头孢他啶、氨曲南、克林霉素、万古霉素等药敏纸片(温州康泰)；DNA提取试剂盒(上海捷瑞)。 1.1.3主要仪器 台式高速冷冻离心机(艾本德中国)，隔水式恒温培养箱(上海森信)，LifePro基因扩增仪(杭州博日)，Gel Doc XR+型凝胶成像系统(美国伯乐)。 1.2方法 1.2.1采样方法 500ml无菌采样瓶选择距水面10—15cm深处取样，加入硫代硫酸钠颗粒，4h之内送检。 1.2.2细菌分离与鉴定[2—7] 将水样增菌后接种于血琼脂平板，37℃培养24 h。按《全国临床检验操作规程》鉴定。对于较难鉴定或生化特性不明显的分离菌，扩增16SrDNA测序比对鉴定。 1.2.3药敏试验[8] 采用K—B法和微量肉汤稀释法测定细菌对抗菌药物的敏感性。 1.2.4超广谱β内酰胺酶(ESBL)的检测[9—11] 按文献操作，进行初筛和确证实验。 1.2.5耐药基因及BLA基因检测[12—13] 按文献设计引物，扩增TEM、SHV、OXA、CTX、aac(3)—I、aac(3)—II、aac(6’)—I、ant(3’’)—I 基因。1%琼脂糖凝胶，110V电泳20 min，凝胶成像仪观察结果。 2 结果 2.1环境水中细菌种类分布 **市环境水细菌种类分布情况见表1。 表1 环境水中细菌种属分布情况 Table1 Bacterial species distribution environment water 样本 来源 Sample source 细菌种属 Bacterial species 合计 Total 弧菌 Vibrio 肠杆菌 Enterobacter 非发酵菌