PFGE标准方法程序.docVIP

PFGE标准程序 胶块制备 在Falcon2054标记样品名称和空白对照，分别加入约1ml细胞悬浊液（CSB） 在1.5ml eppendorf管上标记好对应样品的名称 在模具上标好对应样品的名称 用CSB润湿棉签，从培养皿上刮取适量细菌，均匀悬浊于CSB中，用BioMerieux Vitek colorimeter测其OD值，并调整至3.6~4.5 。如果OD值大于4.5 取300ul细菌悬浊液于相应的1.5ml eppendorf管 从水浴箱中取出eppendorf管加入20ul蛋白酶K20mg/ml）混匀mg/ml。 制备好1% Seakem Gold：1%SDS，放于56℃水浴箱中。 在eppendorf管ul的1% Seakem Gold：1%SDS，快速轻轻颠倒混匀。 立即将混合物加入模具（避免气泡产生），凝固。 1% Seakem Gold：1%SDS时要避免气泡的产生。 混合物加入模具时不能产生气泡。 在加1% Seakem Gold：1%SDS的过程中，1% Seakem Gold：1%SDS要一直放在56℃水浴箱中。 二、细胞裂解 50ml screw-cap tube 标记管加入25ul蛋白酶K（20m/ml） mg/ml，然后颠倒混匀。 每个管子加入5ml蛋白酶K/CLB混合液。 如果想使胶块平齐，可以用刀片削去模具表面多余的部分。 （1）可重复利用的模具：打开模具，用小铲的宽头部分将胶块移入相应的screw-cap管中。 （2）一次性模具：撕掉模具下面的胶带，用小铲将胶块捅进相应的screw-cap管中，将模具、胶带、小铲放入废弃物容器中。 保证胶块在液面下而不在管壁上。 将管子放在54℃水浴摇床中孵育2小时以上，转速约80转/分钟。 将纯水及TE置50℃预热。胶块洗涤 screw-cap管，盖上绿色的screened-cap。轻轻倒掉CLB，。 每管中加入15ml预热的纯水。 确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上，放回50℃水浴摇床50℃水浴摇床15分钟。 10-15分钟TE，加入5-10ml TE，置4℃备用酶切 1．eppendorf管 2．试剂 ul/胶块 ul/10胶块 纯水 180ul 1800ul Buffer 20ul 200ul 总体积 200ul 2000ul ． eppendorf管ul酶切缓冲液。 4．．eppendorf管．．eppendorf管放在37℃水浴中平衡10-15分钟。 8．试剂 ul/胶块 ul/10胶块 纯水 17ul 1750ul Buffer 20ul 200ul 酶 10u/ul 5ul 50ul 总体积 200ul 2000ul ℃保存。 （2） 用枪头吸出缓冲液，避免损伤胶块。 9． 加入200ul。．℃水浴中孵育4小时。 五、加样 胶块直接粘在梳子齿上 ．．℃水浴中取出胶块，平衡到室温。 3．．ul 0.5×TBE，平衡5-10分钟。 5．．．梳子入槽，确保所有胶块在一条直线上，胶块与胶槽底面相接触。从胶槽下部中央缓慢倒入100ml55℃-60℃平衡的1%SKG胶。室温凝固30分钟。．胶块直接加加样孔．．梳子入槽，从槽中央缓慢倒入100ml 55℃-60℃平衡的1%SKG胶室温凝固30分钟。． 小心拔出梳子。．℃水浴中取出胶块，平衡到室温。 5．．ul 0.5×TBE平衡5-10分钟。 7．。．电泳 加入2.2L 0.5TBE，关上盖子。 打开主机和泵开关，泵设于70（缓冲液流速约1L/分钟） 打开冷凝机，确保温度14℃（缓冲液达此温度通常为20分钟左右） 打开胶槽取出凝固的胶，吸水纸清除胶四周及底面多余胶，放入电泳槽 设置电泳参数TBE，100ml用以制胶，50ml用以平衡胶块，余下的用作电泳缓冲液。 （2）在电泳前要先用2000ml纯水循环2小时，再改用2350ml 0.5×TBE循环2小时。电泳结束后TBE先不用放掉，等到下一次电泳前再放掉。 七、?染胶和图像1．胶取出放在400ml EB溶液的托盘内（400ml H2O+40ul 10mg/ml EB）染胶2-30分钟。 2．500ml纯水摇床脱色。 3．Gel Doc 1000、Gel Doc 2000拍摄力图像，储存为*.img或*.lsc文件，转换为*.tif格式用BioNumerics软件进行分析。 4．放掉电泳槽中的TBE，用2L纯水清洗电泳槽，开泵循环5-10分钟，放掉液体。 5．如有的菌株跑不出来，在2L加入10mg/ml硫脲760ul。 注：如在24-28h 内没获得PFGE结果，可采取下面措施： 胶块可裂解更长时间（3-16h）。 TE洗涤时间可以更长（30-45分钟），温度更低（37℃或室温）。 内切酶消化时间更长（3-16h）。 如果H9812最