毕赤酵母表达研进展.docVIP

利用强效可调控启动子AOX1，已高效表达了HBsAg、TNF、EGF、破伤风毒素 C片段、基因工程抗体等多种外源基因［11、12、13］，证实该系统为高效、实用、简便，以提高表达量并保持产物生物学活性为突出特征的外源基因表达系统，而且非常适宜扩大为工业规模［14］ 11. 彭毅，杨希才，康良仪。影响甲醇酵母外源蛋白表达的因素。生物技术通报 2000，4：33-36 12. 11 3 Cregg JM . Tschopp JF Stillman C, et al .High-level expression and efficient assembly of hepatitis B surface antigen in the methylotrophic yeast pichia.pastoris Bio/Technology,1987,5:479-485 13. Sreekrishma K , Nelles L ，Potenz R，et al .High-level expression ,purification ,and characterization of recombinant human tumor necrosis factor synthesized and characterization in the methylotrophic yeast pichia .pastoris ,Biochemistry ,1989,28:4117-4125 14. Siegel RS , Buckholz RG, Thill GP , et al .Production of epider growth factor in methylotrophic yeast cells, International Patent Application ,1990 ,Publication No:WO90/10697 毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。甲醇代谢的第一步是：醇氧 化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要 在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于 醇氧化酶与O2 的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇过氧化 物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。 巴斯德毕赤酵母表达系统是目前最优秀、应用最广泛的外源基因表达系统之一，它不但克服了大肠杆菌表达系统不能表达结构复杂的蛋白质、表达的蛋白多形成不溶性包涵体、背景蛋白多、表达产量低等缺陷，弥补了哺乳类细胞、昆虫细胞表达系统操作复杂、表达水平低、产业化生产造价昂贵的不足，还具有其他酵母表达系统无法比拟的优越之处。该表达系统具有强有力的醇氧化酶基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达；同时作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译后的加工与修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性。此外，该酵母菌营养要求低、生长快、培养基廉价，易于进行操作和培养；其高密度发酵技术业已成熟，便于工业化生产；表达量高，许多蛋白可达到每升克级以上水平；表达的外源蛋白可分泌到胞外，分泌的内源蛋白少，外源蛋白分离纯化简便；外源基因通过质粒整合到基因组上，基因工程菌株遗传稳定性好；胞内表达蛋白的分选和区域化，增加了表达蛋白的稳定性，减少表达产物对宿主菌的毒害作用；糖基化程度低，与酿酒酵母相比，巴斯德毕赤酵母不产生过度的糖基化；所分泌的糖蛋白的免疫原性较低，更利于临床应用。 2 毕赤酵母表达宿主菌 毕赤酵母是甲醇营养型酵母的一种，能在甲醇为惟一碳源的培养基上生长。甲醇能诱导其表达 甲醇代谢所需的酶,如AOX、二羟丙酮合成酶（NDHAS）和过氧化氢酶（catalase）,表达的C)b 和 c+C% 的含量甚至可达到总细胞蛋白的60%-80%。而以葡萄糖、甘油或乙醇为碳源时，AOX几乎不表达。AOX的合成是在转录水平调控的，其基因启动子为诱导型。 目前主要有3种表达宿主菌,它们之间的区别在于AOX1个或 2个基因的缺失，而造成对甲 醇利用能力高低的变化。据甲醇利用能力的改变, 可将毕赤酵母分成三种表现型。SMD1168 和 GS115 菌株含有 AOX1 基因, 这种菌株能快速利用甲醇作为碳源和能源, 能在甲醇培养基中以野生型速率生长, 因此称为甲醇快利用型菌株 ( Mut+) ; KM71 菌株虽不含有 AOX1 基因, 但含有 AOX2 基因, AOX2 基因与AOX1 基因同源性 92%, 其编码的蛋白与 AOX1 基因编码的蛋白有 97%同源性, 能缓慢利用甲醇, 这类菌株为甲醇慢利用型菌株( Muts) ; MC100-3 菌株因 AOX1 和 AOX2