李芳-重组梅毒螺旋体抗原TpN17纯化及基于金磁微粒梅毒螺旋体抗体的检测(西北大学硕士学位答辩)2007.5讲解.pptVIP

梅毒（Syphilis） 是一种由梅毒螺旋体（Treponema pallidum, Tp）引起的性传 染病，发病率逐年递增 。因此，梅毒已经成为一个严重的公共 卫生问题。 检测方法 梅毒螺旋体检测方法比较 金磁微粒概述 应用金磁微粒检测梅毒螺旋体抗体示意图 研究内容及意义 运用阳离子交换层析纯化梅毒螺旋体抗原Tp17并对其进行 HRP 标记，以双抗原夹心法测定纯化及标记抗原的滴度 以金磁微粒为固相载体，建立检测血液中梅毒螺旋体抗体的 方法，为将金磁微粒应用于临床检验提供实验依据 实验一:重组梅毒螺旋体抗原Tp17的纯化 应用CM介质对抗原进行纯化研究 纯化抗原的标记及其滴度测定 重组梅毒螺旋体抗原Tp17的纯化 重组梅毒螺旋体抗原Tp17的表达 Tp17抗原最佳 NH4 2SO4沉淀饱和度的确定 离子交换层析条件的选择与样品的预处理 SDS分析纯化结果 纯化抗原的浓度测定 纯化抗原的标记及其滴度测定 重组梅毒螺旋体抗原Tp17的表达 Tp17抗原最佳 NH4 2SO4沉淀浓度 层析系统的选择 选择CM高流速琼脂糖微球（CM Bio-Sep FF，pH工作范围： 6-10）作为纯化蛋白的层析介质，对上样缓冲液pH值及洗脱缓冲液离子强度进行了确定 SDS对纯化抗原的鉴定 洗脱缓冲液离子强度的选择 HRP标记Tp17抗原 HRP标记Tp17抗原滴度测定 实验二:以金磁微粒为载体检测梅毒螺旋体抗体 运用纯化的Tp17抗原建立梅毒螺旋体抗体磁分离酶联免疫检测方法并将该方法初步应用于血液筛查 运用商品化重组梅毒螺旋体抗原Tp15、Tp17和Tp47，完善上述方法 金磁微粒检测梅毒螺旋体抗体方法的建立 Tp抗原在金磁微粒表面的固定化和封闭 Tp17抗原用于双抗原夹心法检测梅毒螺旋体抗体 临界值的确定 血液筛查中的应用 商品化抗原Tp15、Tp17 和Tp47用于双抗原夹心法 检测梅毒螺旋体抗体 温育时间的选择 精密度分析 灵敏度分析 血液筛查中的应用 Tp17抗原用于检测梅毒螺旋体抗体条件优选 临界值的确定 不同时期梅毒患者血清检测结果 与商品化Tp17抗原的比较 温育时间的选择 精密度分析 灵敏度分析 血液筛查中的应用 小结 建立了以金磁微粒为载体，检测血液中梅毒螺旋体抗体的方法 将纯化的Tp17初步应用于献血筛查。其检测结果和商品化抗原基本相同，但该方法对晚期患者存在一定的漏检 用基因重组梅毒螺旋体抗原Tp15、Tp17和Tp47完善该方法。方法的精密度符合免疫学检测要求且灵敏度高于试剂盒 Thank you 金磁微粒与试剂盒的符合率为98.4% 检测15例早期病人和15例晚期病人血清，检测结果与试剂盒和 临床诊断结果完全一致，运用Tp15、Tpl7和Tp47三种重组联合抗原可以提高检测的灵敏度和特异性 163 160 阴性血样 30 33 阳性血样 商品化试剂盒 金磁微粒系统 检测系统 结果 血样检测结果 梅毒螺旋体抗体检测 西北大学硕士研究生论文答辩 31 梅毒螺旋体抗体检测 西北大学硕士研究生论文答辩 32 * * 重组梅毒螺旋体抗原Tp17的纯化及基于 金磁微粒梅毒螺旋体抗体的检测 答 辩 人: 李 芳 专 业: 细胞生物学 导 师: 崔亚丽 教授 1 　主要内容 主要内容 梅毒和金磁微粒概述 重组梅毒螺旋体抗原Tp17的纯化和标记及其滴 度测定 应用金磁微粒检测梅毒螺旋体抗体方法的建立 西北大学硕士研究生论文答辩 2 梅毒概述 西北大学硕士研究生论文答辩 梅毒概述 3 成本高，不能自动化 特异性高 很高的灵敏度和特异性 梅毒螺旋体明胶凝集试验 梅毒螺旋体酶联免疫吸附试验 不能判断治疗情况 敏感性好 荧光密螺旋体抗体吸收试验 易造成判断差错 敏感性和特异性较好 梅毒螺旋体血球凝集试验 对一期梅毒敏感性不高 肉眼即可读出结果 快速血浆反应素环状卡片试验 对一期梅毒敏感性不高 操作简便，成本低廉 性病研究实验室试验 可导致假阴性 可区分梅毒螺旋体与其它条件致病性螺旋体 免疫荧光染色法 阳性率较低 快速、直接 暗视野显微镜法 缺点 优点 方法 西北大学硕士研究生论文答辩 梅毒概述 4 西北大学硕士研究生论文答辩 金磁微粒概述 定义 金磁微粒 Fe3O4/Au 是结合磁性氧化物粒子和胶体金特点的新型磁性复合微粒。 磁性粒子聚集体 纳米金粒子 5 HRP-TpAg TpAb TpAg Goldmag 梅毒螺旋体抗体检测 西北大学硕士研究生论文答辩 6 研究内容、意义 西北大学硕士研究生论文答辩 7 重组梅毒螺旋体抗原Tp17的纯化 西北大学硕士研究生论文答辩 8